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    白芨多糖對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎治療模型的優(yōu)化和建立

    2022-05-21 09:25:12余雪嫣李雨芯羅毅華
    關(guān)鍵詞:脾臟造模結(jié)腸

    余雪嫣,黃 雪,李雨芯,羅毅華

    (廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病學(xué)消化內(nèi)科,廣西南寧 530021)

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性非特異性炎癥性疾病,病變主要累及結(jié)直腸黏膜及黏膜下層,表現(xiàn)有腹痛、腹瀉、黏液膿血便及體重減輕等,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前,UC 發(fā)病率逐年上升,因其反復(fù)發(fā)作,現(xiàn)有的治療手段無(wú)法完全治愈,大部分患者須終身服藥,已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[1]。近年由于我國(guó)民眾的生活習(xí)慣和生存環(huán)境的改變,國(guó)家醫(yī)療診斷技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化,UC 的檢出率迅速上升[2]。迄今為止,UC 的病因尚未完全明確,目前認(rèn)為可能由環(huán)境、腸道菌群、結(jié)腸免疫功能異常等多重因素相互影響[3]。因此,開(kāi)展UC 的發(fā)病機(jī)制及藥物治療方面研究日益迫切。動(dòng)物模型是研究過(guò)程中不可或缺的手段,構(gòu)建理想且成熟穩(wěn)定的動(dòng)物模型對(duì)UC 發(fā)病機(jī)制、疾病發(fā)展規(guī)律、診療手段及新藥的研究和開(kāi)發(fā)均有重要的研究意義。

    白芨是一種傳統(tǒng)中藥,具有止血、消腫和促進(jìn)組織再生等功效,廣泛用于臨床,已有文獻(xiàn)報(bào)道臨床上應(yīng)用白芨聯(lián)合其他中藥或西藥治療UC 患者均取得了較好的療效[4]。白芨多糖(Bletilla striata polysaccharide, BSP)是一種水溶性多糖,是白芨的主要生物活性物質(zhì),具有抗炎、抗?jié)?、保護(hù)黏膜、促進(jìn)傷口愈合及免疫調(diào)節(jié)活性等多種藥理作用,提示BSP 在臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景及研究?jī)r(jià)值[5]。已有研究表明,BSP 對(duì)UC 動(dòng)物模型具有良好的治療作用,但BSP 對(duì)UC 的作用機(jī)制尚未完全明確,具有廣闊的研究空間。

    目前研究BSP 對(duì)UC 作用的文獻(xiàn)中,對(duì)于UC 動(dòng)物模型的選擇尚不統(tǒng)一。黎笑蘭等[6]采用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)作用于SD大鼠,柯昌毅等[7]和時(shí)松等[8]選用惡唑酮(oxazolidone, OXZ)作用于不同品系的小鼠,而王川[9]采用乙醇作用于SD 大鼠。各個(gè)模型使用的藥物和操作手法差別過(guò)大,很難保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性。同時(shí),以上文獻(xiàn)在進(jìn)行BSP 對(duì)UC 作用研究時(shí),對(duì)BSP濃度的選擇也差別較大,對(duì)最佳藥物濃度并未探討。本研究通過(guò)數(shù)次實(shí)驗(yàn)探索,旨在建立最佳的UC 動(dòng)物模型,并尋找BSP 對(duì)該模型最佳的作用條件和劑量,有利于后續(xù)研究者直接快速地建立模型,減少花費(fèi)并提高效率。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與試劑

    健 康SPF 級(jí)C57BL/6 小 鼠48 只,雄 性,8 周 齡,體質(zhì)量22~24 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCXK 桂2014-0002。室內(nèi)溫度21~25 ℃,相對(duì)濕度(50±10)%,12 h 光照/黑暗循環(huán),按照3R原則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道關(guān)懷。BSP(純度70%,上海源葉生物科技有限公司),DSS(分子量36~50 ku,美國(guó)MP Biomedicals),柳氮磺吡啶腸溶片(Salazosulfapyridine, SASP,上海信誼天平藥業(yè)有限公司),大便隱血測(cè)定試劑盒(干化學(xué)法,美利泰格診斷試劑(嘉興)有限公司),Claudin-1單克隆抗體(Abcam公司),GAPDH抗體(Cell Signaling Technology 公司)等。

    1.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

    將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DSS 模型組及BSP 低、中、高劑量組和SASP 陽(yáng)性對(duì)照組,每組各8 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。將DSS 溶于蒸餾水中配制成25 g/L 的DSS 溶液,且每2 天配制1 次新鮮的DSS 溶液,除正常對(duì)照組給予蒸餾水外,其余各組均采用自由飲用25 g/L 的DSS 溶液以誘導(dǎo)建立小鼠UC模型;連續(xù)飲用7 d,第8天開(kāi)始全部換成蒸餾水。BSP 低、中、高(95、190、380 mg/kg)劑量組和SASP(320 mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組在造模第2 天即開(kāi)始灌胃給藥,灌胃量根據(jù)體質(zhì)量以10 μL/g 計(jì)算;正常對(duì)照組和DSS 模型組同樣按該比例灌胃生理鹽水;每天1 次,連續(xù)7 d,并保證每天給藥均在同一時(shí)段。

    1.3 一般情況的觀察

    實(shí)驗(yàn)期間,每天觀察并詳細(xì)記錄各組小鼠的一般情況、活動(dòng)反應(yīng)、精神狀態(tài)、體毛色澤、進(jìn)食、飲水、體質(zhì)量變化、大便性狀、大便隱血/肉眼便血情況。比較各組小鼠的每日體質(zhì)量變化百分比(%)(每只每天同時(shí)段體質(zhì)量/第1 天體質(zhì)量)。

    1.4 標(biāo)本的采集處理及評(píng)估觀察

    經(jīng)禁食12 h,于造模第9 天采用40 mL/L 的水合氯醛腹腔注射麻醉后處死。乙醇消毒腹部,用高壓消毒后的器械分離肛門(mén)至回盲部腸管,測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度,沿腸系膜緣縱軸剖開(kāi)后迅速用4 ℃的生理鹽水將結(jié)腸沖洗干凈,將結(jié)腸平鋪于干燥濾紙上,肉眼觀察并拍攝記錄小鼠結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度及潰瘍情況,后續(xù)采用COOPER 等[10]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),綜合體質(zhì)量變化、大便性狀和大便隱血/肉眼便血情況對(duì)各組小鼠每天情況進(jìn)行DAI 評(píng)分。

    選取病變明顯結(jié)腸段分成兩份,一份立即放入液氮中,過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?;另一份置?0 g/L 的多聚甲醛固定液中固定24 h,常規(guī)制作4 μm 石蠟切片,經(jīng)HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化,并根據(jù)SHI 等[11]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠結(jié)腸組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。

    器械分離脾臟后,用濾紙吸干并稱(chēng)重,計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

    1.5 Western blotting 法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1 的表達(dá)

    取小鼠結(jié)腸組織,用RIPA 裂解液裂解后勻漿,提取小鼠結(jié)腸組織總蛋白,并用BCA 法測(cè)得蛋白濃度;用120 g/L 的SDS-PAGE 電泳分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后,在50 g/L 的脫脂牛奶中于搖床上室溫封閉1 h,然后將膜分別置于Claudin-1(1∶800)和GAPDH(1∶10 000)的一抗中4 ℃冰箱孵育過(guò)夜;次日,將膜置于熒光二抗(山羊抗兔IgG),搖床室溫避光孵育1 h 后,用近紅外熒光法,將膜放于Odyssey 雙色紅外激光掃膜儀,采用Licor Odyssey V3.0 軟件掃描圖片,再用ImageJ 軟件對(duì)條帶進(jìn)行評(píng)估和量化。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)同時(shí)滿(mǎn)足正態(tài)分布和方差齊性條件時(shí),采用單因素方差(ANOVA)分析,并采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較;當(dāng)數(shù)據(jù)不滿(mǎn)足正態(tài)分布和方差齊性時(shí),采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-WallisH檢驗(yàn),多個(gè)樣本間的兩兩比較采用Nemenyi 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組小鼠的一般情況

    正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常,反應(yīng)靈敏,精神狀態(tài)佳,毛發(fā)有光澤;進(jìn)食飲水正常,體質(zhì)量呈上升趨勢(shì);排便成型,無(wú)血便。DSS 模型組小鼠逐漸精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,倦怠懶動(dòng),毛發(fā)漸漸失去光澤;進(jìn)食減少,體質(zhì)量明顯下降,逐漸出現(xiàn)大便隱血陽(yáng)性或肉眼血便,部分有稀水樣便,提示造模成功。BSP 低、中、高劑量組小鼠在給藥干預(yù)后,上述表現(xiàn)較DSS 模型組均得到改善,而B(niǎo)SP 高劑量組改善最為明顯。

    2.2 小鼠體質(zhì)量的變化

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與正常對(duì)照組相比,DSS 模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01);與DSS 模型組相比,BSP高劑量組小鼠體質(zhì)量降低程度明顯減?。≒<0.05,圖1,表1)。

    圖1 BSP 對(duì)UC 小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of BSP on body weight of UC mice

    2.3 各組小鼠DAI 評(píng)分的比較

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),DSS 模型組小鼠DAI 評(píng)分較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01);與DSS 模型組比較,BSP 高劑量組小鼠DAI 評(píng)分明顯降低(P<0.05,表1,圖2)。

    圖2 BSP 對(duì)UC 小鼠DAI 評(píng)分的影響Fig.2 Effect of BSP on DAI score of UC mice

    表1 各組小鼠體質(zhì)量變化百分比和DAI 評(píng)分的比較Tab.1 Percentage of body mass change and DAI score of UC mice (±s, n=8)

    表1 各組小鼠體質(zhì)量變化百分比和DAI 評(píng)分的比較Tab.1 Percentage of body mass change and DAI score of UC mice (±s, n=8)

    與正常對(duì)照組比較,*P<0.01;與DSS 模型組比較,#P<0.05。

    組別正常對(duì)照組DSS 模型組SASP 陽(yáng)性對(duì)照組BSP 低劑量組BSP 中劑量組BSP 高劑量組體質(zhì)量變化(%)105.82±1.92 85.35±4.53*93.35±4.28*#90.71±3.76*92.03±5.85*#97.41±1.02*#DAI 評(píng)分0.00±0.00 3.98±0.78*2.78±0.50*#3.39±0.25*2.50±0.81*#2.17±0.43*#

    2.4 各組小鼠脾臟指數(shù)的比較

    與正常對(duì)照組比較,DSS 模型組小鼠脾臟腫大,脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01);與DSS 模型組比較,BSP 低、中、高劑量組小鼠脾臟腫大緩解,脾臟指數(shù)均降低(P<0.05,圖3 和表2)。

    圖3 BSP 對(duì)UC 小鼠結(jié)腸和脾臟的影響Fig.3 Effect of BSP on the colon and spleen of UC mice

    2.5 各組小鼠結(jié)腸組織的大體形態(tài)改變及長(zhǎng)度變化

    正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度正常,無(wú)充血水腫和潰瘍;與正常對(duì)照組比較,DSS 模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短(P<0.01),結(jié)腸充血紅腫明顯,局部有糜爛、出血,內(nèi)壁可見(jiàn)淺潰瘍?cè)睿∽兝奂罢谓Y(jié)腸;與DSS 模型組比較,BSP 低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸縮短程度均有減?。≒<0.05),結(jié)腸充血紅腫的癥狀均有減輕,內(nèi)壁潰瘍?cè)蠲黠@緩解,以BSP 高劑量組最為明顯(圖3 和表2)。

    表2 BSP 對(duì)UC 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和脾臟指數(shù)的影響Tab. 2 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colon length and spleen index of UC mice (±s, n=8)

    表2 BSP 對(duì)UC 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和脾臟指數(shù)的影響Tab. 2 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colon length and spleen index of UC mice (±s, n=8)

    與正常對(duì)照組比較,*P<0.01;與DSS 模型組比較,#P<0.05。

    組別正常對(duì)照組DSS 模型組SASP 陽(yáng)性對(duì)照組BSP 低劑量組BSP 中劑量組BSP 高劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度(cm)9.17±0.33 4.90±0.33*7.05±0.52*#5.73±0.40*#6.42±0.40*#6.92±0.44*#脾臟指數(shù)(mg/g)2.42±0.19 5.95±0.61*4.50±0.85*#4.52±0.98*#4.46±1.21*3.57±1.06*#

    2.6 各組小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)評(píng)估

    HE 染色結(jié)果顯示(圖4),正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整,腺體結(jié)構(gòu)完整且排列整齊,基本不見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);DSS 模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮嚴(yán)重破壞、結(jié)構(gòu)紊亂,腺體呈現(xiàn)變形甚至消失,隱窩萎縮扭曲,黏膜及其下層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),偶有隱窩膿腫形成,提示成功構(gòu)建小鼠UC 模型。根據(jù)SHI 等[11]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),綜合炎癥程度、損傷深度、隱窩損傷程度對(duì)小鼠結(jié)腸組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分,每個(gè)組織切片隨機(jī)選取3 個(gè)以上高倍視野(×200),由2 人進(jìn)行盲法評(píng)分,取平均值作為最終結(jié)果。與正常對(duì)照組比較,DSS 模型組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.01);與DSS 模型組比較,BSP 低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜損傷程度均得到改善,組織病理學(xué)評(píng)分均有降低(P<0.05),BSP 高劑量組降低最多,改善也最為明顯(表3)。

    圖4 各組小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變Fig.4 The histopathological changes of the colon in mice of each group(HE staining,×200,ruler=50 μm)

    表3 BSP 對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響Tab. 3 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colonic histopathological score of UC mice (±s,n=8)

    表3 BSP 對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響Tab. 3 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colonic histopathological score of UC mice (±s,n=8)

    與正常對(duì)照組比較,*P<0.01;與DSS 模型組比較,#P<0.05。

    組別正常對(duì)照組DSS 模型組SASP 陽(yáng)性對(duì)照組BSP 低劑量組BSP 中劑量組BSP 高劑量組組織病理學(xué)評(píng)分1.11±0.75 9.11±0.83*5.28±0.68*#7.00±0.81*#5.50±0.96*#3.99±0.99*#

    2.7 BSP對(duì)UC小鼠腸道Claudin-1蛋白表達(dá)的影響

    Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,DSS 模型組腸道緊密連接蛋白Claudin-1 表達(dá)明顯下降(P<0.01);與DSS 模型組比較,BSP 低、中、高劑量組緊密連接蛋白Claudin-1 表達(dá)均明顯增加(P<0.05),其中BSP 高劑量組表達(dá)最接近正常組(圖5)。

    圖5 各組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1 蛋白表達(dá)的比較Fig.5 Comparison of tight junction protein Claudin-1 expression in mouse colon

    3 討 論

    在開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究前應(yīng)根據(jù)研究方向及實(shí)際可行性等,應(yīng)充分考慮動(dòng)物模型和造模方式的選擇。選擇合適的造模對(duì)象,摸索出可靠的造模濃度和方式等,有助于節(jié)省時(shí)間人力,建立高成功率的UC 模型。

    目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)UC 動(dòng)物模型研究頗多?;蛐揎椃▽?duì)技術(shù)和條件要求高,價(jià)格昂貴,且多為單一基因模型,無(wú)法完全模擬人類(lèi)UC 疾病。自發(fā)型動(dòng)物來(lái)源稀少,價(jià)格更貴。免疫誘導(dǎo)法造模周期長(zhǎng),操作復(fù)雜,對(duì)技術(shù)和條件要求也較高,成功率低。由于化學(xué)藥物誘導(dǎo)UC 模型的廉價(jià)、造模方法簡(jiǎn)便、成功率較高,而被廣泛應(yīng)用。既往研究中,王川[9]采用乙酸誘導(dǎo)UC 模型,但該模型是利用其直接刺激作用而引起結(jié)腸出現(xiàn)急性化學(xué)損傷的單純性炎癥反應(yīng),不能反映免疫學(xué)變化,且自愈性強(qiáng),易導(dǎo)致與藥物療效評(píng)價(jià)相混[12];黎笑蘭等[6]選用的TNBS 誘導(dǎo)大鼠UC 模型,炎癥時(shí)間長(zhǎng),缺乏急性期表現(xiàn)[13],且TNBS 模型免疫反應(yīng)以Th1、Th17 反應(yīng)為主,組織學(xué)改變主要是跨膜炎癥和水腫[14],與人類(lèi)克羅恩病癥狀相似,故不適用于UC 的研究;柯昌毅等[7]和時(shí)松等[8]采用的OXZ 誘導(dǎo)UC 模型,建立的疾病維持時(shí)間短、自愈性強(qiáng),同時(shí)還需進(jìn)行皮膚預(yù)致敏操作[15],故亦不做優(yōu)選。DSS 是一種易溶于水的肝素樣硫酸多糖,能抑制血液凝固、血小板聚集、增強(qiáng)纖維蛋白溶解作用及結(jié)腸黏膜組織缺氧,加重腸道出血、產(chǎn)生血便[16],便于直觀觀察是否造模成功。DSS 誘導(dǎo)UC 模型方法簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,易于復(fù)制,周期可長(zhǎng)可短,維持性好,不需灌腸等有創(chuàng)操作,經(jīng)過(guò)多年摸索,建模成功率最高,并且其誘導(dǎo)所致的上皮破壞、局灶性病變和淺表炎癥類(lèi)似于UC 在人體中的表現(xiàn)[17]。DSS 可從多方面破壞腸上皮屏障緊密連接結(jié)構(gòu),使腸黏膜屏障通透性增加,以致菌群和大分子物質(zhì)進(jìn)入黏膜或黏膜下層,進(jìn)而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。這種病理性的定植侵入會(huì)刺激先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,上調(diào)多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌,激活某些通路,類(lèi)似人類(lèi)UC 發(fā)病機(jī)制,是目前最為理想的UC 模型,可作為后續(xù)研究人類(lèi)UC 的免疫機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[18]。故本實(shí)驗(yàn)選此方法進(jìn)行造模。

    不同種屬和種系的動(dòng)物對(duì)DSS 易感性不同,臨床表現(xiàn)、炎癥程度和病變部位也不同。在既往文獻(xiàn)中,黎笑蘭等[6]和王川[9]選用SD 大鼠,柯昌毅等[7]、時(shí)松 等[8]、崔 向 磊[19]分 別 選 用KM 小 鼠、NIH 小 鼠 和BALB/c 小鼠,研究對(duì)象未形成統(tǒng)一。經(jīng)文獻(xiàn)證實(shí),C57BL/6J 小鼠對(duì)DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎敏感,其病變主要集中在中遠(yuǎn)端結(jié)腸,表現(xiàn)為出血、腹瀉、潰瘍、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),與人類(lèi)UC 臨床和組織學(xué)表現(xiàn)相似[20]。同時(shí)C57BL/6J 來(lái)源充足且費(fèi)用低廉、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、樣本量大、體型小、易飼養(yǎng)操作,故本實(shí)驗(yàn)選其作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

    既往研究證明,用分子量較?。?0 ku)的DSS 處理小鼠可出現(xiàn)結(jié)腸炎癥狀,而使用分子量較大(500 ku)的DSS 則無(wú)上述表現(xiàn)。另有研究證明,用分子量5 ku和40 ku 的DSS 分別誘導(dǎo)結(jié)腸炎,后者較前者病變重,且病變主要在遠(yuǎn)端結(jié)腸,所造成的病理變化與人類(lèi)結(jié)腸炎相似[21]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇36~50 ku 的DSS 進(jìn)行造模,其可靠性?xún)?yōu)于崔向磊等[19]使用分子量為5 ku 的DSS 所誘導(dǎo)的UC 模型。

    DSS 濃度是實(shí)驗(yàn)成功至關(guān)重要的因素。DSS 造模通常采用給予20~50 g/L DSS溶液自由飲用5~7 d。一般在給藥后2~3 d 就可出現(xiàn)大便潛血陽(yáng)性和腹瀉;隨后癥狀加重,或有肉眼血便,體質(zhì)量明顯下降,直至6~7 d 出現(xiàn)明顯的結(jié)腸炎癥狀,符合UC 模型急性期的表現(xiàn)[22]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次摸索,最終使用25 g/L 的DSS 很好重復(fù)了前述癥狀。

    DSS 給藥方式多為自由飲用,有學(xué)者質(zhì)疑該方法會(huì)因小鼠飲水量的差異造成DSS 攝入量不同而導(dǎo)致組內(nèi)差異較大。但目前已有多項(xiàng)研究表明,DSS誘導(dǎo)UC 小鼠模型的結(jié)腸黏膜損傷程度主要取決于DSS 濃度,而非攝取的DSS 總量[23]。當(dāng)造模小鼠DSS 總攝取量超過(guò)最低閾值后,即可成功建立急性UC 模型。另有研究者探究了自由飲用和灌胃的差異,結(jié)果顯示DSS 灌胃造模的效果并不及自由飲用法,這可能是小鼠自由飲用方式的攝入緩慢持久,可長(zhǎng)久刺激機(jī)體的結(jié)果;灌胃法藥物代謝速度快,雖給藥量大,但刺激時(shí)間短,效果不佳[24]。

    目前UC 尚無(wú)特異的治療方法,西醫(yī)主要運(yùn)用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑進(jìn)行治療,雖起效快、短期臨床緩解率高,但維持緩解治療長(zhǎng)達(dá)數(shù)年甚至終身,停藥易復(fù)發(fā),不良反應(yīng)多,治標(biāo)不治本[25]。中藥價(jià)廉易得、資源豐富、應(yīng)用廣泛,已有不少?gòu)膫鹘y(tǒng)中藥中分離出的天然產(chǎn)物已被臨床研究及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)UC 具有有益作用。隨著藥理學(xué)的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)一些中藥有效成分(如多糖類(lèi)等)在治療UC 上取得了一定的效果。BSP 作為白芨的主要成分,不僅有止血、促進(jìn)骨髓造血、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、保護(hù)胃黏膜、抗?jié)?、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用,并且具有自身降解性,無(wú)毒副作用,有良好的生物相容性[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BSP 對(duì)UC 有治療作用。與正常對(duì)照組相比,BSP 高劑量組體質(zhì)量下降不明顯、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短不明顯、DAI 評(píng)分升高減少、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分較低,整體作用效果甚至略?xún)?yōu)于SASP陽(yáng)性對(duì)照組,這從多個(gè)角度提示380 mg/kg 的BSP 對(duì)UC 具有最佳的治療效果,是后續(xù)研究者可供選擇的最佳給藥濃度。

    大量研究表明,腸上皮屏障功能障礙與UC 的進(jìn)展有著密不可分的關(guān)系。緊密連接是腸上皮屏障的最重要組成部分,對(duì)于維持腸上皮屏障的正常功能至關(guān)重要[26]。Claudin-1 作為腸上皮屏障緊密連接中的重要蛋白,可通過(guò)檢測(cè)Claudin-1 的表達(dá)觀察BSP 對(duì)腸道屏障的作用,探討其對(duì)UC 的作用。本研究用Western blotting 檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1 的表達(dá),從蛋白水平證明高劑量的BSP 可明顯增強(qiáng)腸道屏障功能從而對(duì)結(jié)腸炎有明顯治療效果,更進(jìn)一步明確了高濃度BSP 是治療UC 的優(yōu)選。

    作為一種低價(jià)且療效甚佳的中藥制劑,BSP 具有廣闊的研究前景。本研究探索BSP 治療UC 小鼠的最佳動(dòng)物模型和藥物干預(yù)濃度,為進(jìn)一步研究BSP 對(duì)UC 的作用打下基礎(chǔ)。本研究既建立了具有典型病理改變的UC 動(dòng)物模型,又找到了合適有效的BSP 藥物干預(yù)濃度,在節(jié)約資源的同時(shí)又具有發(fā)展價(jià)值,具有一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

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