均三氮苯類除草劑阿特拉津和西瑪津及氰草津?qū)C-12 細胞凋亡的影響

吳昊宇，尹亞萍，吳艷萍，馬 焜，李百祥

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150081）

均三氮苯類除草劑屬于選擇性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型低毒除草劑，適用于玉米田、甘蔗田、高粱田等農(nóng)作物[1]。均三氮苯類除草劑作為典型的光合作用抑制劑，可抑制植物的光合作用和呼吸作用，干擾植物激素、氮及核酸代謝，影響土壤微生物的硝化和氨化作用。阿特拉津（atrazine, ATR）、西瑪津（simazine, SIM）、氰草津（cyanazine, CYA）是3 種結(jié)構(gòu)相似的均三氮苯類除草劑，因其具有高效、低毒、廣譜的特點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[2]。這類除草劑可明顯提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，但其半衰期長，不易降解，在土壤、空氣、農(nóng)作物以及地表水或地下水中等均能檢出殘留，對人、畜及土壤中微生物等均具有潛在的環(huán)境毒性作用。研究表明，均三氮苯類除草劑具有免疫毒性，降低大鼠脾臟和胸腺臟器系數(shù)；以及干擾T 淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力[3]；具有生殖和發(fā)育毒性，使哺乳動物性腺發(fā)育異常，精子活性降低，生殖能力下降[4]；還具有遺傳毒性，長期接觸可導(dǎo)致精子和卵巢形態(tài)異常，進而影響正常的胚胎發(fā)育[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，均三氮苯類除草劑可透過血-腦屏障，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，但其具體機制尚未明確。ATR、SIM 和CYA 在結(jié)構(gòu)上存在細微差別（圖1），可能導(dǎo)致其生物學(xué)效應(yīng)明顯不同。PC-12 細胞作為多巴胺能神經(jīng)元體外細胞模型，可以合成、釋放及分泌神經(jīng)遞質(zhì)，如多巴胺、去甲腎上腺素及兒茶酚胺等。因此，在基礎(chǔ)研究和新的臨床治療中，PC-12 細胞可以間接地替代多巴胺能神經(jīng)元[6]。本研究通過體外細胞實驗，初步探討和比較ATR、SIM 和CYA致多巴胺能神經(jīng)元PC-12 細胞凋亡的作用機制，以闡明均三氮苯類除草劑與多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)毒性的關(guān)系，為后續(xù)研究均三氮苯類除草劑的神經(jīng)毒性提供有效的毒理學(xué)依據(jù)。

圖1 阿特拉津、西瑪津和氰草津的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of atrazine, simazine and cyanazine

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

ATR、SIM、CYA（山東濱農(nóng)科技有限公司）；大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤PC-12 細胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心）；CCK-8 試劑盒（日本同仁有限公司）；ROS 測定試劑盒（上海碧云天生物有限公司）；一抗兔抗多克隆抗體Bcl-2、Bax、p53、Caspase-3（美國Immunoway 生物科技有限公司）；二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PrimeScriptRT 試劑盒，SYBR Premix ExTaqII 試劑盒（日本TaKaRa 生物公司）；ABI-7500 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；SDSPAGE 電泳設(shè)備及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

PC-12 細胞用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含有100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素），在50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。對數(shù)生長期PC-12 細胞按照1×104/mL 接種并進行分組，實驗分為ATR 組、SIM 組和CYA 組、對照組，前3 組分別以200 μmol/L 的ATR、SIM 和CYA 處理細胞24 h，而對照組僅添加相同溶劑。每組設(shè)6 個孔。

1.3 CCK-8 試劑盒檢測細胞存活率

將PC-12 細胞接種于96 孔板，邊緣孔用無菌PBS 填充，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至細胞單層鋪滿孔底時，按1.2 項 分 組 干 預(yù)，分 別 以200 μmol/L ATR、SIM 和CYA 處理細胞24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于450 nm 處測量各孔的吸光度值（A），計算PC-12 細胞存活率。

1.4 ROS 含量檢測

對數(shù)生長期PC-12 細胞經(jīng)胰酶消化、離心收集后制成細胞懸液，按1.2 項分組，分別滴在經(jīng)過高壓滅菌的蓋玻片上，置于6 孔板中于50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿玻片時，分別以200 μmol/L ATR、SIM 和CYA 處理細胞24 h 進行干預(yù)。棄去細胞培養(yǎng)液并向每孔中加入1 mL 終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min。用無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基洗滌細胞3 次后，用激光共聚焦顯微鏡（200 倍）于488 nm 波長下觀察并拍攝ROS 熒光照片，進行細胞計數(shù)和分析。

1.5 RT-PCR 檢測PC-12 細胞中相關(guān)基因的相對表達情況

對數(shù)生長期PC-12 細胞按1.2 項分組，置于6 孔板中于50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿玻片時，分別以200 μmol/L ATR、SIM 和CYA 處理24 h 后收集細胞，并用Trizol 法提取細胞RNA。用含有g(shù)DNA Eraser 的PrimeScriptRT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒進行實時熒光定量檢測，各基因引物序列見表1。RT-PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃10 min，1 cycle→95 ℃15 s，40 cycle→60 ℃1 min，40 cycle。以β-actin 作為內(nèi)參，對每個樣本基因表達數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化，獲得至少3 次重現(xiàn)性良好的數(shù)據(jù)。并通過計算循環(huán)閾值CT值來確定基因的相對表達，目的基因mRNA 的相對表達=2-ΔΔCT，ΔΔCT=（CT實驗組目的基因-CT實驗組管家基因）—（CT對照組目的基因—CT對照組管家基因）。

表1 RT-PCR 的各基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.6 Western blotting 檢測PC-12 細胞中相關(guān)蛋白的相對表達情況

對數(shù)生長期PC-12 細胞置于6 孔板中，按1.2 項分組，于50 mL/L CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿玻片時，分別以200 μmol/L 的ATR、SIM和CYA 處理24 h 后收集細胞，提取總蛋白，將各組蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為20 μg/μL進行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜后，加入Bcl-2、Bax、p53和Caspase-3一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。隔天用TBST 洗膜3 次并加入二抗稀釋液（1∶2 000），勻速震蕩1 h。用TBST 和TBS 分別洗膜1 次后，用ECL 顯色液進行顯色，并對各泳道條帶進行灰度掃描，得出相應(yīng)的蛋白表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用±s表示。組間差異和兩兩比較采用單因素方差和LSD-t檢驗分析，以P＜0.01 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8 檢測細胞存活率情況

與對照組相比，ATR 組、SIM 組 和CYA組細胞的存活率均明顯下降（P＜0.01）；與ATR 組相比，SIM 組和CYA 組細胞的存活率明顯上升（P＜0.01）；與SIM 組相比，CYA 組細胞的存活率明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 CCK-8 檢測均三氮苯類除草劑處理PC-12 細胞24 h 的存活率比較Fig. 2 CCK-8 detected the survival rate of PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h

2.2 ROS 檢測結(jié)果

與對照組相比，ATR 組、SIM 組和CYA 組細胞內(nèi)ROS 活性均明顯升高（P＜0.01）；與ATR 組相比，SIM組和CYA 組細胞內(nèi)ROS 活性明顯下降（P＜0.01）；與SIM 組相比，CYA 組ROS 活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。

圖3 ROS 試劑盒檢測均三氮苯類除草劑處理PC-12 細胞24 h 的ROS 水平變化（A）及統(tǒng)計學(xué)分析（B）Fig.3 ROS level(A)and static analysis (B)in PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h by ROS kit

2.3 PC-12 細胞中Bax、p53、Bcl-2 和Caspase-3 mRNA 的表達情況

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，ATR組、SIM組和CYA組細胞內(nèi)Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 表達均升高，Bcl-2 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）；與ATR 組相比，SIM 組和CYA 組細胞內(nèi)Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 表達明顯 降低，Bcl-2 mRNA 表達明顯升高（P＜0.01）；與SIM 組相比，CYA 組細胞內(nèi)Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 表達明顯降低，Bcl-2 mRNA 表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖4）。

圖4 均三氮苯類除草劑處理PC-12 細胞24 h 時RT-PCR 檢測結(jié)果的比較Fig.4 The detection results of RT-PCR in PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h

2.4 PC-12 細胞中Bax、p53、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，ATR組、SIM組和CYA組細胞內(nèi)Bax、p53和Caspase-3蛋白表達均升高，Bcl-2蛋白表達均明顯降低（P＜0.01）；與ATR 組相比，SIM 組和CYA 組細胞內(nèi)Bax、p53 和Caspase-3 蛋白表達均明顯降低，Bcl-2 蛋白表達均明顯升高（P＜0.01）；與SIM 組相比，CYA 組細胞內(nèi)Bax、p53 和Caspase-3 蛋白表達明顯降低，Bcl-2 蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖5）。

圖5 均三氮苯類除草劑處理PC-12 細胞24 h 時Western blotting 檢測結(jié)果的比較Fig.5 Western blotting detection of PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h

3 討 論

由于均三氮苯類除草劑具有潛在的生態(tài)毒性及環(huán)境蓄積性，在歐洲各國已被禁用，但在中國、美國等國家仍在使用[7]。研究表明，長期、低劑量暴露于除草劑如ATR、SIM、CYA，可導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥的發(fā)生，提示這類除草劑對神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在毒性[8-9]。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，ATR 組、SIM 組和CYA 組細胞的存活率均明顯下降，SIM 組和CYA組細胞的存活率明顯高于ATR 組，說明相同條件下ATR 對PC-12 細胞的生長抑制率最大，毒性作用最強。同時，研究表明，3 組細胞內(nèi)ROS 活性均顯著升高，以ATR 組ROS 水平最高，由于PC-12 細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS 主要由NADPH 氧化酶合成，ROS 水平異常升高可導(dǎo)致細胞內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速自由基產(chǎn)物的增多并影響線粒體功能，促進細胞凋亡的發(fā)生[10-11]。

Bcl-2 作為主要的抗凋亡蛋白家族成員之一，目前，其抗凋亡機制主要如下：①拮抗促凋亡基因Bax；②抑制促凋亡蛋白細胞色素C 自線粒體釋放到胞質(zhì)；③阻止胞質(zhì)中的細胞色素C 激活Caspase；④有抗氧化及維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等作用。Bcl-2 家族的促凋亡蛋白Bax 一般出現(xiàn)在胞質(zhì)中，當(dāng)細胞響應(yīng)外界損傷或刺激等凋亡信號后，Bax 蛋白可與Bcl-2 形成異二聚體，抑制Bcl-2 的抗凋亡功能，使線粒體內(nèi)膜的通透性降低，Bax 將重新定位于線粒體表面，進而激活Caspase 蛋白的信號級聯(lián)反應(yīng)，通過破壞線粒體膜的完整性發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bcl-2 的比例是對細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素[12]。

同時，p53 作為Bcl-2 基因轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控因子，也參與了細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展[13]。本研究結(jié)果表明，均三氮苯類除草劑可明顯抑制PC-12 細胞存活，其中，以ATR 的 抑 制 作 用 最 為 明 顯；ATR、SIM 和CYA 處 理 后，PC-12 細 胞 內(nèi)Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 及蛋白表達均升高，Bcl-2 mRNA 及蛋白表達均明顯降低。這說明均三氮苯類除草劑染毒可激活細胞的凋亡途徑，引起PC-12 細胞的損傷和死亡。

然而，這3 種藥物所表現(xiàn)出的毒性大小也有所不同的，這可能是由3 種藥物分子結(jié)構(gòu)中C-6 位置引入的側(cè)鏈不同導(dǎo)致的。ATR 分子母核C-6 位置引入的側(cè)鏈中有異丙基結(jié)構(gòu)，分子脂溶性較強，容易透過細胞膜而產(chǎn)生毒性作用；SIM 分子母核C-6 位置引入的側(cè)鏈中含有乙基，脂溶性相對較弱，毒性作用也較弱；CYA 母核C-6 位置引入的側(cè)鏈中含有氰基，使分子的親水性增加，因而增大了藥物分子透過細胞膜的難度，發(fā)揮毒性作用的效果最弱[14-16]。

綜上所述，均三氮苯類3 種不同除草劑對PC-12都具有明顯的神經(jīng)毒性作用，可激活細胞凋亡途徑促進PC-12 細胞發(fā)生凋亡，其毒性強弱依次為ATR 最強，SIM 次之，CYA 最弱。本研究的初步結(jié)果將為深入研究均三氮苯類除草劑致多巴胺神經(jīng)元的損傷機制奠定基礎(chǔ)，為深入探討農(nóng)藥類環(huán)境污染因素在神經(jīng)退行性疾病中的作用提供了毒理學(xué)依據(jù)。