羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性油脂成分的提取優(yōu)化

黎燕媚，聶影影，劉亞月，周龍建，宋 采，洪鵬志,4，張永平，胡雪瓊，張 翼,,4

羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性油脂成分的提取優(yōu)化

黎燕媚1，聶影影2,3，劉亞月1，周龍建1，宋 采1，洪鵬志1,4，張永平1，胡雪瓊1，張 翼1,2,3,4

（1. 廣東海洋大學食品科技學院 / 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 / 廣東省海洋生物制品工程實驗室 / 廣東省海洋食品工程技術研究中心 / 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室 / 廣東省現(xiàn)代農業(yè)科技創(chuàng)新中心 / 湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點實驗室 / 海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088 ；2. 廣東海洋大學深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心，廣東 深圳 518120 ；3. 大連工業(yè)大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；4. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江市），廣東 湛江 524006）

【】建立藥食同源海藻羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活性油脂成分的優(yōu)化提取工藝，探明其主要活性組分的具體化學成分。以提取物質量濃度1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率× 提取物質量為指標，比較各個溶劑比、料液質量體積比、超聲時間和提取次數(shù)等四個單因素水平下的抑制AChE活性成分提取效果，確定各個單因素中的最優(yōu)水平范圍，進而設計正交實驗優(yōu)化提取工藝條件；按最優(yōu)提取工藝條件下提取制備粗浸膏，運用硅膠柱色譜法、薄層層析等方法對粗浸膏進行分離純化并追蹤其活性組分，運用氣相色譜-質譜聯(lián)用GC-MS進行成分分離與鑒定。羊棲菜抑制AChE活性成分的最優(yōu)提取條件為：溶劑乙酸乙酯、石油醚體積比為5∶5，料液質量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時間30 min，提取次數(shù)3次。此條件下對應的提取物質量濃度1 mg/mL下乙酰膽堿酯酶抑制率（%） × 提取物質量（g）的值為7.078 ± 1.038。從該粗提物中分離得到兩個具有抑制AChE活性的組分Fr2和Fr3，主要成分為花生四烯酸、亞油酸、油酸等脂肪酸，F(xiàn)r3還含有十四烷等多種烷烴。其抑制IC50值分別為2.69 mg/mL和5.31 mg/mL。本研究確定的基于石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的超聲提取工藝可得到較高產量的羊棲菜抑制AChE活性成分，其主要成分為脂肪酸，可能在改善記憶方面具有一定應用價值。

羊棲菜；正交實驗；阿爾茨海默癥；抑制乙酰膽堿酯酶活性；脂肪酸

阿爾茨海默病（Alzheimer?s Disease，AD）是一種神經退行性疾病，其特征是神經元的破壞性改變，包括神經纖維纏結和淀粉樣斑塊，導致認知障礙。發(fā)病機制包括膽堿能缺失假說、基因學說、氧化應激與自由基損傷學說、炎性免疫學說、Aβ異常沉積、Tau蛋白異常磷酸化、神經血管假說以及細胞周期假說等多種假說[1, 2]。其中膽堿能缺失學說是目前治療AD藥物研發(fā)的主要機制。膽堿能缺失假說認為神經遞質乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）的缺失在AD病理學中起關鍵作用，ACh是處理記憶和學習過程必不可少的一種神經遞質[3]。ACh存儲在神經元的突觸囊泡中，當突觸囊泡發(fā)生胞外作用時，ACh被釋放到突觸間隙并與ACh受體結合產生信號傳導作用[4]，乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）可將ACh分解為膽堿和醋酸鹽從而終止神經傳導信號的發(fā)生[5]。

羊棲菜（，也稱），別名鹿角尖、海菜芽、羊奶子、海大麥等，屬褐藻類馬尾藻科，食用和藥用價值越來越受到重視[6]。目前對羊棲菜的功能活性成分的研究主要集中在抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、治療心血管疾病和提高免疫力方面[9]。研究表明，羊棲菜中多種提取成分與治療AD也具有密切關系。羊棲菜多糖可能通過調控和基因的表達來抑制細胞凋亡從而可以干預AD的發(fā)生[10]；羊棲菜多酚通過增強體內抗氧化能力，減少氧化產物的堆積以降低腦組織的損傷來預防AD的發(fā)生[11]；羊棲菜中甾醇24(S)-Saringosterol的抗炎作用可能有助于預防認知能力下降[12]?？梢娧驐嗽陂_發(fā)改善記憶、防治阿爾茨海默癥的功能食品或藥物方面也具有較好應用前景。

本實驗室前期從產自浙江洞頭的食用海藻羊棲菜中發(fā)現(xiàn)了一種功能性油脂HFFO（functional oil），其具有較強的抑制AChE活性，且主要的活性化合物為花生四烯酸和11,14,17-二十碳三烯酸[13]。但前期研究采用的溶劑系統(tǒng)（氯仿-甲醇）對功能食品的溶劑使用許可及實際生產中可能會造成的殘留等問題考慮不足，且提取工藝也未經優(yōu)化?；诖?，本研究考慮到今后可能的功能食品用途，采用沒有足夠毒性資料的第四類溶劑[14]石油醚和對人類風險較低的第三類溶劑[15]乙酸乙酯作為溶劑體系，通過考察溶劑比、料液質量體積比、超聲提取時間、提取次數(shù)等因素對羊棲菜中HFFO提取效果的影響，優(yōu)化HFFO粗品提取的工藝條件，對在此條件下進一步純化分離得到的HFFO進行抑制AChE活性評價和具體成分的分析，旨在為大規(guī)模制備HFFO成分用于深入的動物模型功效研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊棲菜，2020年08月購自浙江省溫州市洞頭金海水產，為養(yǎng)殖產品；HFFO（作為本研究提取物的抑制AChE活性的對照，實驗室原保存），采用氯仿甲醇混合溶液提取，經過柱層析分離純化，詳細制備方法見文獻[13]；石油醚（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號20200620）；乙酸乙酯（分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號20200516）；正己烷（分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號20200509）；溴甲酚綠（天津市北辰方正試劑廠）；乙酰膽堿酯酶（AChE）（Sigma-Aldrich公司，批號C3389）；碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）（Sigma-Aldrich公司，批號A0048）；5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）（Sigma-Aldrich公司，批號D8130）；牛血清白蛋白（BSA）（上海源葉生物科技有限公司，批號L27M11S113313）；GF254硅膠高效薄層層析板，購自德國默克公司；酶標板（NEST?品牌96孔平孔板-300 μL，無錫耐思生命科技股份有限公司）。

1.2 儀器

400Y型粉碎機（鉑歐五金制品有限公司）；KH-300ZDE型超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)有限公司）；SB-1300型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；WFH-201B型多功能紫外透射儀（上海精科實業(yè)有限公司）；HPX-9082MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；Biotek Epoch2型酶標儀（美國博騰有限公司）；GCMS-QP2010 Ultra型氣質聯(lián)用儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 樣品預處理

將羊棲菜除去雜質后，置于烘箱內40 ℃干燥1 h，放入粉碎機中粉碎（粉末粒度約1 mm），4 ℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 羊棲菜中抑制乙酰膽堿酯酶活性樣品成分的提取工藝條件

2.2.1 單因素實驗的設計 稱取羊棲菜粉末每份25 g于500 mL錐形瓶中，加入一定比例的乙酸乙酯和石油醚混合溶液后靜置常溫浸泡12 h后，固定超聲功率360 W?？紤]到樣品活性強度和得率均為重要目標，故以1 mg/mL劑量下的AChE抑制率×提取物質量為指標，分別考察提取溶劑比（石油醚、乙酸乙酯體積比10∶0，石油醚、乙酸乙酯體積比8∶2，石油醚、乙酸乙酯體積比5∶5，石油醚、乙酸乙酯體積比3∶7，石油醚、乙酸乙酯體積比0∶10），料液質量（g）體積（mL）比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶16），超聲時間（0、10、20、30、40 min），提取次數(shù)（1、2、3、4）對羊棲菜中抑制AChE活性油脂成分的提取效果的影響。每個考察因素均設4 ～ 5個水平，3個平行。

2.2.2 正交實驗的設計 通過單因素實驗確定溶劑比、料液質量體積比、超聲時間、提取次數(shù)各因素的最優(yōu)實驗范圍，因素水平表見表1。在單因素實驗的基礎上采用四因素三水平L9（34）表進行正交試驗優(yōu)化。由于考慮到正交表L9（34）各列均被因素排滿，表中未留下空列，也無歷史資料提供經驗誤差，為了避免增加試驗次數(shù)，不使用更大的正交表，故參照文獻[16]設置重復實驗，估算實驗誤差，以進行方差分析。每項實驗平行重復3次，以1 mg/mL劑量下的AChE抑制率（%）×提取物質量（g）為指標，確定羊棲菜中抑制AChE活性油脂成分的最佳提取條件。按最佳提取條件進行提取，評定提取效果。

表1 正交實驗因素水平

2.2.3 羊棲菜粗浸膏得率的測定方法 稱取25 g羊棲菜粉末于500 mL錐形瓶中，按照一定的條件進行提取，提取結束后進行常壓過濾，將濾液在真空旋轉蒸發(fā)儀上進行濃縮后，得羊棲菜粗浸膏。然后根據(jù)以下公式計算羊棲菜粗浸膏的質量。

羊棲菜粗浸膏的質量 =2–1，

式中，2為濃縮樣品后瓶子的總質量，1為空旋蒸瓶質量。

2.2.4 羊棲菜粗浸膏薄層層析及生物自顯影分析 參照文獻[17]，略有改動。對各因素水平下獲得的羊棲菜粗浸膏以石油醚、乙酸乙酯體積比4∶1為展開劑進行薄層層析（Thin Layer Chromatography，TLC）展開，記錄254 nm紫外圖像、365 nm熒光圖像、乙酰膽堿酯酶抑制活性自顯影圖像和溴甲酚綠顯色圖像。溴甲酚綠顯色實驗步驟：0.1 g溴甲酚綠溶于500 mL乙醇中，緩慢加入0.1 mol/L NaOH溶液，至剛好出現(xiàn)藍色沉淀。用配制好的溴甲酚綠顯色劑均勻噴在GF254板子上，脂肪酸類物質會在藍色背景產生黃色斑點，然后拍照記錄即時圖像。

2.2.5 羊棲菜粗浸膏中抑制AChE活性的測定 參照文獻[17]，略有改動。每孔的反應體系均為100 μL，先將各因素水平下獲得的羊棲菜粗浸膏樣品用DMSO配制成100 mg/mL溶液，設置四個組，樣品組（A1）：加入配好的待測樣品1 μL + 49 μL 磷酸鹽緩沖液PBS（100 mmol/L）+ 10 μL AChE溶液（0.2 U/mL）+ 20 μL DTNB（5 mmol/L），將板子置于控溫培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育10 min，然后加入20 μL底物ATCI（10 mmol/L），再放入37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫孵育20 min ；樣品對照組（A2）將AChE溶液換成BSA（1 mg/mL），其它操作同樣品組；空白組（A3）：不加入樣品，其它同樣品組；空白對照組（A4）：不加入樣品，其它同樣品對照組。全部孵育完成，將96孔板置于酶標儀，測定其在405 nm波長下的光密度值，根據(jù)公式計算AChE抑制率（%）：

AChE抑制率 = [（A3A4）-（A1A2）]/（A3A4），

式中，A1為樣品組溶液的光密度；A2為樣品對照組溶液的光密度；A3為空白組溶液的光密度；A4為空白對照組溶液的光密度。

2.3 羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的分離純化

2.3.1 常壓正相硅膠柱（硅膠粒徑為0.048 mm ～ 0.075 mm）分離活性組分 稱取200 g羊棲菜粉末按照2.2.2節(jié)的步驟得到的最佳提取條件進行提取得到粗浸膏。運用硅膠柱色譜方法，將粗浸膏進行初步分離純化以除去色素。分離純化步驟如下：依次用石油醚、98%（體積分數(shù)，本節(jié)同）石油醚、95%石油醚、90%石油醚、85%石油醚、80%石油醚、70%石油醚、100 %乙酸乙酯進行洗脫，得到8個組分Fr1 ～ Fr8。采用2.2.4節(jié)方法確定活性組分。

2.3.2 活性組分抑制乙酰膽堿酯酶活性IC50的測定 活性組分溶解于DMSO中并配成系列濃度（1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6 mg/mL），測定步驟同2.2.5節(jié)，在酶標板中分別測定活性組分系列濃度的AChE抑制率，鹽酸多奈哌齊作為陽性對照。IC50值是化合物對AChE抑制率為50%所對應的濃度。以抑制率為縱坐標和濃度對數(shù)（ln）為橫坐標導入Origin 8.0軟件。通過3次多項式回歸方程擬合得到濃度對數(shù)曲線，并計算得到ln（IC50）和IC50。

2.4 羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性組分的氣質聯(lián)用分析

2.4.1 樣品前處理（甲酯化） 根據(jù)活性結果，分別稱取抑制AChE抑活性最強的組分Fr2和組分Fr3各40 mg，用1 mL的正己烷溶解，加入1 mL 0.4 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，充分振蕩，置于70 ℃水浴中超聲1 h。靜置后，取出上層清液，加入飽和食鹽水至9 mL，于5 000 r/min條件下離心10 min。靜置后，樣品分3層（上層為甲酯化產物，中層為未甲酯產物，下層為水層），取出上層溶液，在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮干燥后稱其質量，用正己烷配成1 mg/mL溶液，過孔徑0.22 μm有機濾膜，備用。

2.4.2 氣相色譜-質譜聯(lián)用GC-MS條件 柱溫箱80 ℃，進樣口溫度280 ℃，分流比為5，載氣為He，升溫程序如下：0 ～ 2 min，80 ℃；2 ～ 6 min，80 ～ 120 ℃；6 ～ 11 min，120 ℃；11 ～ 16 min，120 ～ 180 ℃；16 ～ 22 min，180 ℃；22 ～ 32 min，180 ～ 280 ℃；32 ～ 60 min，280 ℃。離子源溫度為250 ℃，接口溫度為280 ℃，質荷比m/z范圍為50 ～ 500。通過與美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜圖庫和中國科學院南海海洋研究所的GC-MS 系統(tǒng)譜圖庫比對來確定化合物的成分。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

本研究中所有實驗重復3次，單因素實驗結果分析均用Graphpad Prism 8.0作圖，采用One-way ANOVA和Dunnett′s post hoc檢驗評價每個因素中不同水平之間的差異。正交試驗的方差分析用軟件SPSS 25進行分析處理。

3 結果與分析

3.1 不同提取條件羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分比較

如圖1(A3～D3)所示，著色背景上的空白斑點為抑制AChE活性成分所在，結果表明各單因素的不同水平下羊棲菜粗浸膏抑制AChE活性均較強，活性組分均分布在f（活性組分的遷移距離與展開劑的遷移距離之比）為0.5左右，相應活性位置的溴甲酚綠顯色均為黃色（圖1(A4-D4)），可初步判定此位置上的活性物質為具有抑制AChE活性的脂肪酸類物質，可見不同提取條件對活性產物的成分種類可能影響不大，但從抑制斑點面積看主要影響其產率，故進一步通過定量評價提取效果的單因素分析和正交試驗。

A1 ～ D1: 254 nm紫外圖像；A2 ～ D2: 365 nm熒光圖像；A3 ～ D3: 抑制AChE活性自顯影；A4 ～ D4: 溴甲酚綠顯色。

3.2 不同條件對羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取的影響（單因素實驗）

3.2.1 溶劑比對羊棲菜抑制AChE活性成分提取的影響 結果如圖2所示，隨著乙酸乙酯比例的增大，1 mg/mL 劑量下AChE抑制率×粗浸膏質量的值隨之增大，當溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為0∶10時達到最大的值。因此選取溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5、3∶7、0∶10為正交實驗的水平范圍值。

料液質量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時間20 min，提取1次。與溶劑體積比10∶0 比較，*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜0.01，***表示P ＜ 0.001。

3.2.2 料液質量體積比對羊棲菜抑制AChE活性成分的影響 結果如圖3所示，當料液質量（g）體積（mL）比為1∶10時，1 mg/mL劑量下AChE 抑制率×粗浸膏質量的值達到最大。因此，選取料液質量（g）體積（mL）比1∶8、1∶10、1∶12為正交實驗的水平范圍值。

3.2.3 超聲時間對羊棲菜抑制AChE活性成分提取的影響 結果如圖4所示，隨著超聲時間的增加，1 mg/mL 劑量下AChE抑制率×粗浸膏質量的值隨之增大，當超聲時間為30 min時，達到最大值。因此，選取超聲時間20、30、40 min作為正交實驗的水平范圍值。

3.2.4 提取次數(shù)對羊棲菜抑制AChE活性成分提取的影響 結果如圖5所示，隨著提取次數(shù)的增加，1 mg/mL 劑量下AChE 抑制率×粗浸膏質量的值隨之增大。當提取次數(shù)為3次時，達到最大值。因此，選取提取次數(shù)2、3、4次作為正交實驗的水平范圍值。

溶劑體積比為5∶5，超聲時間20 min，提取1次。與料液質量比1∶12 比較，**表示P ＜ 0.01。

溶劑體積比為5∶5，料液質量體積比為1∶10，提取1次。與超聲時間0 min比較，*表示P ＜ 0.05。

3.3 不同條件對羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取的影響（正交實驗）

正交實驗結果如表2、3。由正交實驗結果值可知，以1 mg/mL 劑量下AChE抑制率×粗浸膏質量的值為指標考察羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性成分的最佳提取條件為1222，即溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5，料液質量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時間為30 min，提取次數(shù)3次。由正交實驗結果值和方差分析結果可知，四個因素對結果的影響順序依次為：溶劑比（）＞超聲時間（）＞提取次數(shù)（）＞料液比（）。

按照確定的最佳提取工藝1222，即溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5，料液質量（g）體積（mL）比1∶10，超聲時間30 min，提取次數(shù)3次，此提取條件下羊棲菜粗浸膏質量為（0.240±0.014）g，1 mg/mL粗浸膏的AChE抑制率為（25.251±1.157）%，1 mg/mL粗浸膏的AChE抑制率×粗浸膏質量的值為6.061±0.414，指標值高于正交實驗中其他試驗號，說明該工藝可靠、穩(wěn)定。

溶劑體積比為5∶5，料液質量體積比為1∶10，超聲時間20 min。

表2 羊棲菜中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取工藝正交實驗結果

表3 羊棲菜中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分提取工藝正交實驗方差分析

注Note: ***表示差異極顯著highly significant difference（< 0.001）。

3.4 羊棲菜粗浸膏中抑制乙酰膽堿酯酶活性組分分離純化

由圖6(C、D)可知，羊棲菜抑制AChE活性成分可能存在于 Fr2 ～ Fr4組分中，但是組分Fr4已經有比較重的色素成分（圖6(B)），為避免色澤對后續(xù)保健功能食品開發(fā)的影響，暫不對Fr4組分進行下一步的研究。由表4可知，組分Fr2的抑制AChE的IC50值為2.69 mg/mL，組分Fr3的抑制AChE的IC50值為5.31 mg/mL，兩者均有一定的AChE抑制活性，因此后續(xù)的分析主要集中在組分Fr2和Fr3中。

A：254nm紫外圖像；B：365nm熒光圖像；C：乙酰膽堿酯酶抑制活性自顯影；D：溴甲酚綠顯色

表4 各組分的抑制AChE活性

3.5 羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性組分分析

3.5.1 亞組分Fr2的氣質聯(lián)用分析 經過活性引導分離得到一個具有一定抑制AChE活性的亞組分Fr2，對其進行GC-MS分析，結果見表5。其不飽和脂肪酸占比為64.54%，其成分主要有亞油酸（23.08%）、油酸（31.73%）、花生四烯酸（7.04%）、二十碳五烯酸（2.69%）。飽和脂肪酸中，棕櫚酸成分最大，占比17.37%。

表5 GC-MS分析揭示經過甲酯化處理的Fr2主要成分

3.5.2 亞組分Fr3的氣質聯(lián)用分析 活性亞組分Fr3的主要成分中，不飽和脂肪酸占比為8.92%，其中花生四烯酸占主要成分，占比5.25%。其余組分為烷烴類（30.49%）、2,4-（1,1-二甲基乙基）-苯酚（3.42%）、1-丁基-2-（8-甲基壬基）-鄰苯二甲酸酯（2.18%）、6,6?-雙（2-叔丁基-3-甲基苯酚）甲烷（3.16%）等（表6）。

表6 GC-MS分析揭示經過甲酯化處理的Fr3組分主要成分

4 討論與結論

本研究表明，羊棲菜抑制AChE活性油脂成分的最優(yōu)提取條件：溶劑石油醚、乙酸乙酯體積比為5∶5，料液質量（g）體積（mL）比為1∶10，超聲時間為30 min，提取次數(shù)3次。周佩佩等[18]研究表明，超聲結合溶劑浸提法能夠更好提取海藻中的總脂成分。常用的溶劑有石油醚、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等兩種或多種溶劑的組合等，本實驗考慮到后續(xù)功能食品等方面的應用，未采用本實驗前期HFFO提取方法中的氯仿、甲醇等溶劑，而改用了相對安全的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑[14,15]。在基于石油醚-乙酸乙酯的溶劑提取單因素實驗結果分析中，隨著乙酸乙酯用量的增加，1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率×提取物質量值隨之增加，這可能是因為乙酸乙酯比石油醚更加能溶解羊棲菜中的油脂成分。張秀研等[19]研究表明，乙酸乙酯作為提取溶劑時，油脂產率比石油醚的高。本研究中，當料液質量（g）體積（mL）比在1∶10時，1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率×提取物質量值達到最大值，隨著料液比的增大，其值反而下降。通常適當?shù)牧弦罕瓤墒乖辖莞映浞?，達到更好的分離效果，當溶劑量達到一定程度后，物料與溶劑之間會趨于平衡[20]。夏夢露等[21]在對影響銅藻（）多不飽和脂肪酸的提取因素的研究中發(fā)現(xiàn)，適當?shù)牧弦罕瓤稍黾鱼~藻中多不飽和脂肪酸的提取量，而料液比過大，銅藻中多不飽和脂肪酸的提取量反而減少。而且，在保證能達到足夠得率后，采用更高的料液比也會造成實際生產中成本的增加，故本研究中最終采用1∶10的料液比。在本研究中，當超聲時間為30 min時，1 mg/mL下的乙酰膽堿酯酶抑制率×提取物質量值達到最大值，之后隨著超聲時間的增加，其值反而下降，出現(xiàn)下降的原因可能是由于油脂中存在一些揮發(fā)性成分[22]，在提取時間過長，超聲熱效應過大，溫度過高時，揮發(fā)性成分會損失，導致油脂提取率下降。且超聲過長不僅增加成本，還可能會使油脂的成分受到影響。超聲的空泡效應可能導致羥基自由基的產生，過強的超聲處理會導致多酚等易氧化植物活性成分的破壞[23]。在脂質提取中也有類似現(xiàn)象報道，Hadiyanto等[24]在研究超聲輔助滲透壓沖擊法提取鈍頂螺旋藻中脂質組分中發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時間的延長，脂質提取率增大，當超聲時間35 min時達到最大值，之后隨著超聲時間延長，脂質提取率下降。夏夢露等[21]也發(fā)現(xiàn)，適當?shù)某曁崛r間可提高銅藻中多不飽和脂肪酸的提取率，而超聲時間過長反而導致多不飽和脂肪酸提取率的下降。

本研究分離得到亞組分Fr2和Fr3的成分主要包括棕櫚酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸等，前期實驗室分離得到的HFFO樣品主要含有花生四烯酸、11,14,17-二十碳三烯酸、棕櫚酸和植物醇等[13]。兩者在成分上有一定的差異，出現(xiàn)這種差異的原因可能有：1）很多研究表明[25-27]，海藻中的脂肪酸種類和含量會隨著生長地域、環(huán)境、季節(jié)等變化而呈現(xiàn)顯著差異。2）考慮到實驗室前期研究所用的溶劑體系與本研究不同，這也可能導致實驗室HFFO樣品成分與亞組分Fr2和Fr3在成分上有較大的差異。前期實驗室分離得到的HFFO抑制AChE的IC50值為1.09 mg/mL，且生物活性追蹤證實AChE抑制活性主要來自花生四烯酸和11,14,17-二十碳三烯酸。亞組分Fr2和Fr3的AChE抑制IC50值分別為2.69 mg/mL、5.31mg/mL，F(xiàn)r3的AChE抑制IC50值擬合方程2距離1有較大偏離，可能是因為Fr3的AChE抑制活性比較弱，測量誤差較大導致的。亞組分Fr2和Fr3主要的活性來源也可能是花生四烯酸。另外Fr2組分中油酸、亞油酸也為主要的成分，它們不僅是構成人體組織的重要組成成分，還具有預防心血管疾病的作用，也曾被報道過具有溫和的抑制AChE活性，其抑制AChE的IC50值分別為12.01 μg/mL和18.17 μg/mL[28]。

相對于前人關于羊棲菜的多糖、多酚、甾醇等抗AD成分研究開發(fā)[10-12]，本研究更注重其不飽和脂肪酸的利用，且本研究在安全提取溶劑方面進行了有益探索。季節(jié)對活性成分化學組成差異的影響有待進一步研究，其確切體內功效還有待深入的動物模型實驗驗證。

綜上所述，本研究建立了一種藥食同源海藻羊棲菜中抑制AChE活性組分HFFO的優(yōu)化提取與純化制備工藝，驗證了優(yōu)化工藝下提取產物的抑制AChE活性，發(fā)現(xiàn)基于石油醚-乙酸乙酯超聲提取羊棲菜中抑制AChE活性組分HFFO的最優(yōu)提取條件為溶劑乙酸乙酯、石油醚體積比5∶5，料液質量（g）體積（mL）比1∶10，超聲時間30 min，提取次數(shù)3次，將此提取條件下提取得到的羊棲菜粗浸膏結合柱層析法分離純化制備得到了兩個活性油脂組分Fr2和Fr3，其抑制AChE的IC50值分別為2.69 mg/mL和5.31 mg/mL，并通過GC-MS揭示了Fr2和Fr3活性組分主要富含花生四烯酸、油酸、亞油酸等成分，在制備輔助改善記憶的功能食品方面可能具有一定的應用價值。

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Extraction Optimization of Acetylcholinesterase Inhibitory Active Oils from

LI Yan-mei1, NIE Ying-ying2,3, LIU Ya-yue1, ZHOU Long-jian1, SONG Cai1, HONG Peng-zhi1,4, ZHANG Yong-ping1, HU Xue-qiong1, ZHANG Yi1,2,3,4

（1.,,,,,,,,,,524088,; 2.,,518120,; 3.,,116034,; 4.(),524006,）

【】To establish an optimized extraction process for acetylcholinesterase (AChE) inhibitory components fromand to analyze and identify the chemical constituents. 【】Taking the product of inhibition rate to AChE at the dose of 1 mg/mL and extract mass (PIREM) as indicator, the optimal level range of each single factor was determined by comparing the extraction effects under different ratios of solvents, ratios of solid to liquid, ultrasonic times, and extraction times. Then, the extraction process was optimized by orthogonal experiment design. Under the optimal extraction condition,was extracted to obtain the crude extract, which was separated and purified to trace the active components by silica gel column chromatography and thin layer chromatography. Finally, the constituents of the product was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. 【】The results showed that the optimal extraction condition was, volume ratio of ethyl acetate topetroleum ether is 5∶5 as solvent, solid-liquid ratio = 1∶10 (g/mL), ultrasonical extraction for 30 min and three times. The PIREM value was 7.078 ± 1.038 for the crude extract obtained under this condition. From this extract, two main active components Fr2 and Fr3 were prepared with inhibitory IC50values of 2.69 mg/mL and 5.31 mg/mL, respectively. Their main constituents were revealed to be fatty acids like arachidonic acid, linoleic acid, oleic acid and also rich alkanes like tetradecane in Fr3. 【】By the supersonic extraction process based on mixed solvent of petroleum ether and ethyl acetate in this study, high yield of AChE inhibitory components can be prepared from. This product mainly contains fatty acids and may be applicable for improving memory.

; orthogonal experiment; Alzheimer's disease; acetycholinesterase inhibition; fatty acid

黎燕媚，聶影影，劉亞月，等. 羊棲菜抑制乙酰膽堿酯酶活性油脂成分的提取優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（3）：97-106.

Q547

A

1673-9159（2022）03-0097-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.013

2021-12-30

廣東省科技專項資金-基礎與應用基礎研究專題（2021A05240）；廣東省普通高校重點領域專項（生物醫(yī)藥與健康）（2021ZDZX2064）；深圳市大鵬新區(qū)科技研發(fā)項目（KJYF202001-07）；深圳市科創(chuàng)委基礎研究面上項目（JCYJ20190813105005619）；深圳市大鵬新區(qū)產業(yè)發(fā)展資金（KY20180203）；國家自然科學基金（21807015）；廣東省揚帆計劃引進緊缺拔尖人才項目（201433009）；湛江市海洋經濟創(chuàng)新發(fā)展示范市建設項目（湛海創(chuàng)XM-202008-01B1）；廣東省高等學?？萍紕?chuàng)新團隊項目（2021KCXTD021）。

黎燕媚（1994―）女，碩士研究生，研究方向為海洋天然產物。E-mail：guangdongliyanmei@163.com

張翼（1978―），男，博士，教授，研究方向為海洋天然產物。E-mail：hubeizhangyi@163.com

（責任編輯：劉朏）