不同方法制備豌豆-草魚雙蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠特性比較

周小虎，章超樺，趙良忠，周曉潔，黃展銳，周春霞，曹文紅，鄭惠娜

不同方法制備豌豆-草魚雙蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠特性比較

周小虎1,2，章超樺1,3，趙良忠2，周曉潔2，黃展銳2，周春霞1,3，曹文紅1,3，鄭惠娜1,3

（1．廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2．邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院 // 豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽 422000；3．大連工業(yè)大學(xué)/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

【】基于熱誘導(dǎo)凝膠特性評(píng)價(jià)共混合法和共沉淀法制備豌豆（L.）-草魚（）雙蛋白的優(yōu)劣。以豌豆和草魚為原料，采用等電點(diǎn)共沉淀法制備豌豆分離蛋白（PPI）、草魚分離蛋白（CPI）和豌豆-草魚共沉淀雙蛋白（Co）；將PPI與CPI以質(zhì)量比1∶1直接混合得到豌豆-草魚共混合雙蛋白（BL）。以單一蛋白PPI、CPI為對(duì)照，分析4種蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和熱誘導(dǎo)蛋白凝膠品質(zhì)，比較BL和Co的熱誘導(dǎo)凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。與BL比較，Co的游離巰基含量更高（＜0.05），表面疏水性更低（＜0.05），vicilin與legumin α+β光密度比值是BL的2.82倍。Co熱誘導(dǎo)凝膠品質(zhì)較好，持水性和硬度分別為91.75%、42.60 g，顯著高于BL、PPI、CPI（＜0.05），微觀結(jié)構(gòu)均勻、致密，凝膠性質(zhì)總體優(yōu)于PPI、CPI、BL，體現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)作用；BL則表現(xiàn)出一定的拮抗效應(yīng)。共沉淀法制備的雙蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性優(yōu)于共混合法。

雙蛋白；共沉淀；共混合；凝膠特性；豌豆蛋白；草魚蛋白

目前，優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白質(zhì)如肉、蛋、乳的需求不斷增加，但高動(dòng)物蛋白膳食模式會(huì)導(dǎo)致溫室氣體過度排放。植物蛋白更為經(jīng)濟(jì)，但植物蛋白難以全面滿足必需氨基酸需求，純素膳食不適合所有消費(fèi)群體[1,2]。動(dòng)植物蛋白混合屬于“蛋白質(zhì)互補(bǔ)”，能較好滿足營(yíng)養(yǎng)和環(huán)保的需求。我國(guó)提出“雙蛋白工程”戰(zhàn)略，在《國(guó)民營(yíng)養(yǎng)計(jì)劃》將雙蛋白描述為：以優(yōu)質(zhì)動(dòng)物、植物蛋白為主要營(yíng)養(yǎng)基料制成的食品[3]。

雙蛋白按制備方法可分為共混合雙蛋白（Protein blends，BL）和共沉淀雙蛋白（Protein co-precipitates，Co）[4]。BL指分離蛋白直接混合制成的蛋白。研究表明豌豆與鱈（）分離蛋白BL的乳化性比單一蛋白更好，體現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)[5]。而研究證實(shí)，BL由于蛋白來源不同，其分子物理構(gòu)型（植物球蛋白、動(dòng)物肌纖維蛋白）不相容產(chǎn)生的空間位阻會(huì)破壞凝膠結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致凝膠特性出現(xiàn)拮抗效應(yīng)[6,7]。Co采用等電點(diǎn)-共沉淀法制備而成，具體是在pH的驅(qū)動(dòng)下，不同來源的蛋白質(zhì)在同一體系中同時(shí)溶解和沉淀，促進(jìn)異源蛋白之間的相互作用，生成二硫鍵，改變蛋白質(zhì)亞基組成、表面電荷、溶解性和表面疏水性，從而有效改善功能性質(zhì)[8]。豆類和油菜籽Co比單一蛋白具有更好的營(yíng)養(yǎng)和功能特性[9]，大豆和乳清Co具有較高的持水和成膠能力[10]。可見BL和Co的凝膠在功能特性上存在明顯差異。

豌豆分離蛋白（Pea protein isolate，PPI）是優(yōu)質(zhì)植物蛋白，低價(jià)易得，且具有較好的成膠能力，有助于鎖住水分、風(fēng)味成分等[11]，目前主要與多糖或其他蛋白復(fù)配使用[12]。草魚（）是四大家魚之一，富含蛋氨酸。在大宗淡水魚中，草魚分離蛋白（Grass carp protein isolate，CPI）凝膠強(qiáng)度最高[13]，應(yīng)用時(shí)需進(jìn)行修飾或與其他蛋白混合[14]。課題組前期研究豌豆-草魚雙蛋白的溶解、起泡、乳化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，BL和Co相比單一蛋白均有一定協(xié)同效應(yīng)，且Co優(yōu)于BL[15]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)大豆-羅非魚（）Co的凝膠性質(zhì)在部分條件下優(yōu)于單一蛋白[16]。目前，尚未見到對(duì)BL與Co凝膠性質(zhì)比較的研究報(bào)道，并鮮見植物蛋白高比例替代動(dòng)物蛋白的研究報(bào)道?；诖?，本研究選擇豌豆蛋白與草魚蛋白質(zhì)量比均為1∶1的BL和Co兩種雙蛋白為研究對(duì)象，以單一蛋白PPI、CPI作為對(duì)照，通過分析熱誘導(dǎo)凝膠特性，評(píng)價(jià)共混合法和共沉淀法制備雙蛋白的優(yōu)劣，探討豌豆蛋白與草魚蛋白相互作用對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響，以期為改進(jìn)豆類-魚類雙蛋白制備方法提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去皮豌豆購自佛山金諾一農(nóng)產(chǎn)品加工廠；草魚購自廣東省湛江市湖光市場(chǎng)，取背部的白色肌肉，除盡血水后置于-20 ℃冷凍，48 h內(nèi)處理完畢；MD1477透析袋購于上海源葉生物科技有限公司；快速電泳試劑盒購自中國(guó)上海碧云天生物科技有限公司；ANS熒光探針和DTNB購自上海阿拉丁生化科技有限公司；Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒購自上海荔達(dá)生物科技有限公司；2-巰基乙醇和三羥甲基氨基甲烷Tris購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸Gly和其他試劑均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

Avanti J-26sxp高效離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；ALPHA1-2LD plus臺(tái)式凍干機(jī)，德國(guó)Christ公司；G9800A熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Agilent公司；Gemini 300型掃描電鏡，德國(guó)ZEISS公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；TA-1質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)AMETEK有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PPI、CPI、BL和Co制備 PPI、CPI、Co參考本課題組前期研究[15]采用等電點(diǎn)沉淀法制備。將去皮豌豆磨成粉末，過孔徑150 μm篩。將豌豆粉與4 ℃去離子水按質(zhì)量比1∶9的比例混合。用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10.0，攪拌溶解30 min，然后在10 000、4 ℃條件下離心20 min，除去沉淀。在上清液中緩慢加入1 mol/L HCl，充分?jǐn)嚢瑁{(diào)pH調(diào)至5.0，同樣條件離心，取沉淀。用去離子水沖洗沉淀，調(diào)整pH值至7.0，透析。冷凍干燥48 h后得到PPI。將魚背部白肉剪切打漿后，重復(fù)PPI制作步驟制備CPI。將豌豆粉與魚肌肉混合，按照PPI制作步驟制備Co。將PPI與CPI的干粉直接混合得到BL。本研究中BL和Co中豌豆與草魚蛋白質(zhì)量比為1∶1。

1.3.2 熱誘導(dǎo)凝膠制備 將4種蛋白粉樣品配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的蛋白溶液，置于恒溫水浴鍋中，按升溫速度1 ℃/min升溫至90 ℃保持30 min，后快速冷卻，將凝膠樣品在4 ℃下存放6 h，待用。

1.3.3 游離巰基含量 蛋白質(zhì)樣品中游離SH含量參照Beveridge等[17]改進(jìn)的Ellman法測(cè)定。取樣品100 mg溶解于10 mL含8 mol/L尿素的Tris-gly緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly，0.04 mol/L EDTA，pH 8.0）中，緩慢攪拌，放置6 h，備用。游離SH含量測(cè)定：取1 mL上述蛋白溶液，加入4 mL Tris-Gly緩沖液，再加入0.05 mL Ellman（5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸DTNB，4 mg/mL）混合，反應(yīng)5 min后在412 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。游離巰基摩爾質(zhì)量濃度（μmol/g）計(jì)算方法如下：

SH = 73.53 ×(412 nm) × 1 000 ÷，

式中，為樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）；1 000為稀釋倍數(shù)；73.53由106/（1.36×104mol?L-1?cm-1）計(jì)算得到，1.36×104為摩爾吸光系數(shù)。

1.3.4 表面疏水性 參照文獻(xiàn)[15]采用ANS熒光探針法對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 蛋白質(zhì)亞基組成 采用非還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE表征BL和Co的蛋白質(zhì)亞基原始組成。條件為：樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%；濃縮膠（上層膠）體積分?jǐn)?shù)5%，分離膠（下層膠）體積分?jǐn)?shù)12%；不添加還原劑二硫蘇糖醇（DTT）；蛋白Marker 16 ～ 270 ku；染色劑考馬斯亮藍(lán)R-250。蛋白條帶豐度通過ImageLab軟件測(cè)定。

1.3.6 分子間作用力 采用蛋白質(zhì)溶解度法，參考劉書成等[18]方法分析蛋白質(zhì)分子間作用力。將2 g凝膠樣品加入提取液（10 mL 0.6 mol/L NaCl），以5 000 r/min均質(zhì)3 min后在4 ℃下靜置30 min，然后在4 ℃、10 000條件下離心25 min，上清液置于4 ℃待用（此時(shí)蛋白溶液記為S1），取沉淀進(jìn)行后續(xù)操作。S2、S3、S4重復(fù)上述操作，提取液分別為S2（10 mL 1.5 mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl），S3（10 mL 8 mol/L尿素，0.6 mol/L NaCl），S4（10 mL 0.5 mol/L 2-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl、8 mol/L尿素，pH 7.0）。為減少對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾，將S1、S2、S3、S4與質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸溶液等體積混合，然后在4 ℃、4 000條件下離心15 min，棄去上清液，取沉淀溶于5 mL 1 mol/L NaOH中，采用lowry法[19]測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。溶解于S1、S2、S3、S4的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別代表體系中離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵在體系中對(duì)蛋白質(zhì)分子間作用力的貢獻(xiàn)。

1.3.7 持水性 稱取約8 g的凝膠樣品，兩層濾紙包裹置于離心管后稱取總質(zhì)量，于4 ℃、5 000條件下離心10 min，取出凝膠并稱其質(zhì)量。持水力（WHC）計(jì)算公式如下：

式中0為離心管質(zhì)量（g）；1為離心前凝膠和離心管總質(zhì)量（g）；2為離心后凝膠和離心管總質(zhì)量（g）。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)分析（Texture Profile Analysis，TPA） 對(duì)樣品進(jìn)行TPA，主要參數(shù)設(shè)定：P35圓柱型平底探頭測(cè)定，樣品表面平整高度為20mm，設(shè)定測(cè)前、中、后速度分別為4.0、3.0和4.0mm/s，下壓距離為樣品高度的40%，中間停留時(shí)間為5 s，觸發(fā)力為5 g。每個(gè)樣品重復(fù)6次。

1.3.9 微觀結(jié)構(gòu)觀察 凝膠樣品切成5 mm × 2 mm × 2 mm，置于帶蓋容器中，用體積分?jǐn)?shù)2.5% pH 7.2的戊二醛磷酸緩沖液在4 ℃條件下固定浸泡8 h以上，再用0.1 mol/mL pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10 min。用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%乙醇溶液梯度洗脫，每次10 min。用100%的無水乙醇繼續(xù)洗脫3次，每次10 min。取三氯甲烷對(duì)脫水后的樣品進(jìn)行脫脂1 h，用體積比為1∶1的乙醇和叔丁醇混合液置換15 min，用100%的叔丁醇溶液置換15 min后凍干。采用離子濺射鍍膜法對(duì)樣品鍍金，用掃描電子顯微鏡在5 000×視野下觀察樣品表面形貌。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)均至少進(jìn)行3次。統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 25.0進(jìn)行。兩組間的統(tǒng)計(jì)差異采用單因素方差分析（ANOVA）和Duncans多范圍檢驗(yàn)（0.05）。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)游離巰基含量和表面疏水性指數(shù)（H0）

4種蛋白質(zhì)的游離巰基含量和表面疏水性如圖1所示。CPI的巰基質(zhì)量摩爾濃度最高，為（29.35 ± 0.75）μmol/g，Co顯著高于BL（＜0.05）。游離巰基是蛋白質(zhì)最活躍的基團(tuán)，在熱誘導(dǎo)成膠時(shí)隨著蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)打開，其會(huì)逐漸暴露并氧化生成—S—S—共價(jià)鍵?！猄—S—共價(jià)鍵是交聯(lián)的強(qiáng)作用力，對(duì)凝膠硬度至關(guān)重要，能促進(jìn)蛋白的聚集和交聯(lián)，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。而二硫鍵含量與凝膠硬度正相關(guān)[22]，可見Co的成膠性能優(yōu)于BL。表面疏水性與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)。ANS熒光探針法可用于表征蛋白質(zhì)中疏水基團(tuán)的暴露情況[20,21]。PPI、CPI、BL的表面疏水性無顯著差異（＞0.05），均大于Co（＜0.05）?？赡苁且?yàn)楣渤恋矸ㄊ雇愣沟鞍缀筒蒴~蛋白之間通過疏水作用結(jié)合，在解折疊-折疊過程中比共混合法埋藏了更多的疏水基團(tuán)，發(fā)生了“疏水坍塌”[23]。Co的表面疏水性指數(shù)表現(xiàn)為非線性疊加，比BL更低。溶解性與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合前期研究[15]可知Co的溶解度更好，而溶解是蛋白從溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z的必要條件?？梢奀o有較好的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成基礎(chǔ)。

2.2 蛋白質(zhì)亞基組成

非還原SDS-PAGE分析BL和Co的蛋白組成情況如圖2和表1所示。兩種雙蛋白均包含肌球蛋白重鏈（MHC，約200 ku），convicilin（約70 ku），豆球蛋白（legumin，約62 ku），vicilin（約50 ku），肌動(dòng)蛋白（AC，約42 ku），legumin α（約38 ku），原肌球蛋白（TM，約34 ku），legumin β（約22 ku）以及聚集體（頂部條帶），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24,25]?？梢妰煞N雙蛋白均有效復(fù)合來自豌豆和草魚的蛋白質(zhì)，可用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

凡含一個(gè)相同字母表示不同蛋白間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

圖2 共混合雙蛋白和共沉淀雙蛋白的非還原電泳圖譜

非還原電泳可反映混合蛋白中各種蛋白質(zhì)的原始組成情況[26]。蛋白樣品制備時(shí)，BL和Co中蛋白來源控制為豌豆草魚質(zhì)量比1∶1，而電泳圖中二者蛋白條帶差異明顯，說明Co和BL中的豌豆和草魚蛋白的亞基交聯(lián)或變性的程度不同。類似研究認(rèn)為，其差異的原因可能是等電點(diǎn)沉淀法制取Co時(shí)，蛋白質(zhì)之間靜電相互作用、疏水相互作用、二硫鍵的作用不一樣[8]。觀察到分離膠頂部有部分聚集物，結(jié)合之前研究[15]，說明不同源蛋白之間通過二硫鍵互作聚集；并且Co與BL相比，聚集程度更為明顯，表明Co新生成了更多的二硫鍵?？扇苄跃奂锸菬崮z過程中穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要因素[6]。vicilin和legumin是豌豆球蛋白的主要成分。vicilin是一種柔性蛋白質(zhì)，而legumin屬于“剛性”球蛋白，對(duì)凝膠形成的空間位阻更大[27]。表1可知，vicilin與legumin α+β光密度比值Co（2.04）高于BL（0.72），達(dá)2.82倍。已有研究證實(shí)，豌豆蛋白的vicilin與legumin α+β光密度比值與溶解、乳化、凝膠等功能性質(zhì)存在正相關(guān)[28]。由蛋白組成分析可得到重要提示，Co的凝膠特性可能優(yōu)于BL。

表1 豌豆-草魚共混合蛋白和共沉淀蛋白的電泳條帶光密度

2.3 凝膠的分子間作用力

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)受熱解折疊，會(huì)引發(fā)聚集和交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)分子間作用力的重構(gòu)。這些作用力可被特定的化學(xué)試劑破壞，通過測(cè)試不同化學(xué)試劑中蛋白溶解度占比，以表征蛋白凝膠中分子間作用力的貢獻(xiàn)情況[29]。圖3所示，疏水相互作用和離子鍵是PPI熱誘導(dǎo)凝膠的主要作用力，二硫鍵和疏水相互作用是CPI凝膠的主要作用力，BL主要是疏水相互作用、二硫鍵和離子鍵，而Co則主要是二硫鍵和疏水相互作用，說明蛋白質(zhì)種類以及不同的混合方式影響著凝膠的分子間相互作用。離子鍵的破壞而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和凝膠化[18]。離子鍵對(duì)4種蛋白成膠的貢獻(xiàn)不高，PPI最大（33.90%），Co最低（10.79%），主要原因是本實(shí)驗(yàn)條件（pH = 7）下，蛋白體系均帶負(fù)電存在靜電斥力，PPI和CPI等電點(diǎn)分別為4.5和5.2，PPI的電負(fù)性更大，使蛋白熱變性后結(jié)構(gòu)伸展帶電基團(tuán)靜電作用更強(qiáng)。

經(jīng)比較，4種蛋白凝膠的氫鍵貢獻(xiàn)率均為最低。氫鍵在熱變性時(shí)會(huì)出現(xiàn)斷裂和重建[30]。從40 ℃到90 ℃的凝膠化過程中氫鍵貢獻(xiàn)是降低的，并且認(rèn)為氫鍵不是維持其凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力[31]。BL的氫鍵貢獻(xiàn)率顯著高于其它3種蛋白凝膠（＜0.05），說明BL通過氫鍵將PPI和CPI結(jié)合，或者蛋白的共混合促進(jìn)了其中某一種蛋白的氫鍵作用。

比較4種蛋白凝膠的疏水鍵貢獻(xiàn)度，發(fā)現(xiàn)BL較高（43.45%），這與氫鍵類似，說明在熱變性溫度以上時(shí)，蛋白疏水基團(tuán)充分暴露并聚集，成為熱誘導(dǎo)BL形成凝膠的主要機(jī)制之一。此外，與蛋白質(zhì)表面疏水性測(cè)量結(jié)果相比，BL的疏水鍵貢獻(xiàn)率相對(duì)較高，是因?yàn)閮煞N蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)由于分子構(gòu)型不相容（植物球蛋白、動(dòng)物肌纖維蛋白），空間位阻造成相互“擠占”行為，更大尺度的凝膠網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)“互拆”現(xiàn)象，必然導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間距較大；其他的蛋白質(zhì)分子作用力最多只有5 nm左右，而疏水鍵的作用長(zhǎng)度可達(dá)約100 nm[32]，這可能是疏水鍵貢獻(xiàn)率較大的原因。疏水聚合屬于熱力學(xué)熵驅(qū)動(dòng)，其鍵能很低，不能決定凝膠最終品質(zhì)[33]。

凡含一個(gè)相同字母表示不同蛋白間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。大寫字母表示同一作用力不同蛋白間的比較，小寫字母表示同一蛋白不同作用力間的比較

CPI和Co的熱誘導(dǎo)凝膠二硫鍵貢獻(xiàn)占比分別為53.42%、44.57%，顯著高于PPI和BL（＜0.05），這與巰基含量測(cè)定和蛋白亞基組成分析結(jié)果基本一致。二硫鍵屬于強(qiáng)共價(jià)鍵，決定蛋白凝膠最終品質(zhì)[34]。Co的巰基含量低于CPI，其二硫鍵卻顯著高于CPI，說明共沉淀法制備雙蛋白的過程中保留了更多的活性巰基，在受熱條件下能生成更多的二硫鍵，鞏固凝膠結(jié)構(gòu)，增加凝膠強(qiáng)度[35]，提示共沉淀法雙蛋白熱誘導(dǎo)凝膠品質(zhì)存在優(yōu)勢(shì)。

2.4 凝膠持水性

圖4所示，Co凝膠的持水性為91.75%，顯著高于CPI、PPI、BL（＜0.05），表現(xiàn)出不同蛋白質(zhì)混合的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。BL略低于PPI（＞0.05），表現(xiàn)為一定程度的拮抗作用。持水性對(duì)食品的質(zhì)構(gòu)和感官至關(guān)重要，是衡量凝膠優(yōu)劣的重要指標(biāo)[36]。蛋白質(zhì)凝膠的持水性通常取決于凝膠微觀結(jié)構(gòu)和硬度。電泳分析可知，Co的可溶性聚集物明顯多于BL。有研究發(fā)現(xiàn)，具有細(xì)小結(jié)構(gòu)的凝膠比粗糙的凝膠有利于產(chǎn)生更多蛋白質(zhì)-水之間的相互作用[37]，具有更高的持水能力。同時(shí)，Co和CPI的二硫鍵貢獻(xiàn)率較高，意味著更大的凝膠硬度以及提升凝膠網(wǎng)絡(luò)束縛水分子的能力，在離心條件下水分子不易游離出來，能提高蛋白凝膠的持水性。

凡含一個(gè)相同字母表示不同蛋白間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.5 凝膠質(zhì)構(gòu)特性

PPI、CPI、BL和Co熱誘導(dǎo)蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)測(cè)試結(jié)果如圖5所示。與持水性測(cè)定結(jié)果類似，Co凝膠的硬度最高，達(dá)到524.60 g，這是因?yàn)楣渤恋矸ㄊ沟鞍追肿娱g二硫鍵增多，豌豆蛋白和草魚蛋白之間交聯(lián)的增加[38]。即在中性pH條件下，共沉淀法雙蛋白相對(duì)單一蛋白而言，提高了凝膠硬度，可見共沉淀法能有效解決植物蛋白以較高比例替代動(dòng)物蛋白后凝膠硬度降低的加工難題。此外，4種凝膠的彈性無顯著差異（＞0.05），其中BL的彈性較高，但硬度最低，這是因?yàn)轸~肌原纖維蛋白變性溫度較低，受熱后蛋白質(zhì)分子優(yōu)先聚集，而過快的聚集速度會(huì)導(dǎo)致分子鏈在還未完全展開時(shí)便發(fā)生隨機(jī)交聯(lián)，形成結(jié)構(gòu)較為粗糙的凝膠?？梢夿L在食品加工中應(yīng)用會(huì)受到一定限制。

凡含一個(gè)相同字母表示不同蛋白間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.6 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電鏡觀察蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖6所示，4種蛋白均有明顯差異。PPI因球蛋白vicilin和legumin的熱變性溫度不同，二者在程序式升溫的熱凝膠條件下無法同時(shí)展開球蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行交聯(lián)，因此凝膠網(wǎng)絡(luò)延展性不夠，孔洞較多，導(dǎo)致持水性和硬度不理想。CPI的凝膠網(wǎng)絡(luò)整體呈現(xiàn)有規(guī)律纖維狀，較為均勻致密，對(duì)應(yīng)著較高的持水性和硬度。這是因?yàn)榧∏虻鞍追肿訜嵴T導(dǎo)凝膠的形成機(jī)制是肌球蛋白分子的頭-頭交聯(lián)、頭-尾交聯(lián)和尾-尾交聯(lián)。凝膠聚集結(jié)點(diǎn)可能是頭-頭交聯(lián)區(qū)域，定向纖維可能是頭-尾和尾-尾的交聯(lián)區(qū)域[39]。BL凝膠網(wǎng)絡(luò)存在較大孔洞，孔口周圍排列大量非網(wǎng)絡(luò)蛋白的聚集物，必然造成持水性和硬度差，表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。這是因?yàn)榍虻鞍缀屠w維蛋白分子構(gòu)型不相容，形成空間位阻效應(yīng)使其難以交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)；同時(shí)因?yàn)椴煌鞍谉嶙冃詼囟认嗖钶^大，如PPI為80 ～ 90 ℃[40]，而CPI的肌球蛋白在40 ～ 50 ℃即開始變性[41]，導(dǎo)致聚集過程和展開過程不同步，不易形成致密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，甚至出現(xiàn)相分離[6,42]。Co凝膠的微觀結(jié)構(gòu)較為均勻、致密，使其具有更好的良好持水性和硬度。這是因?yàn)橄啾菳L，共沉淀法制備的雙蛋白的巰基較多，而Co在熱誘導(dǎo)成膠時(shí)生成了較多二硫鍵，同時(shí)變性溫度與肌纖維蛋白接近的vicilin含量更高，兩種蛋白結(jié)構(gòu)交織在一起形成均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，高密度孔隙結(jié)構(gòu)且穩(wěn)定的凝膠可以有效的固定水分和提升質(zhì)構(gòu)性。

圖6 4種熱誘導(dǎo)蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

Co熱誘導(dǎo)凝膠中二硫鍵對(duì)穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)率最高，持水性、質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)等全面優(yōu)于單一蛋白和BL，發(fā)揮了協(xié)同作用，而BL表現(xiàn)一定的拮抗效應(yīng)。共沉淀法制備Co使不同來源蛋白質(zhì)進(jìn)行了亞基重組，改變了巰基含量和疏水性。因此，從凝膠性質(zhì)而言，共沉淀法制備的雙蛋白比共混合法更有優(yōu)勢(shì)。

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Comparative Analysis of Heat-induced Gel Properties of Pea-grass Carp Dual-protein Prepared by Different Methods

ZHOU Xiao-hu1,2, ZHANG Chao-hua1,3, ZHAO Liang-zhong2, ZHOU Xiao-jie2, HUANG Zhan-rui2, ZHOU Chun-xia1,3, CAO Wen-hong1,3, ZHENG Hui-na1,3

（1.,//,524088,; 2.//,422000,; 3.,y,116034,）

【】The advantages and disadvantages of preparation of dual-protein by blending and co-precipitation are to be evaluated based on the properties of heat-induced gel.【】Pea protein isolate (PPI), grass carp protein isolate (CPI) and pea-carp protein co-precipitates (Co) were prepared from pea and grass carp by isoelectric solubilization/co-precipitation method. PPI and CPI were blended at a mass ratio of 1∶1 to get pea-grass carp protein blended (BL). Using single protein PPI and CPI as control, the physicochemical properties of the four proteins and quality indexes of the four heat-induced protein gels were analyzed, and the structure and properties of heat-induced gel of BL and Co were compared.【】Compared with BL, Co has higher sulfhydryl content (＜0.05), lower surface hydrophobicity (＜0.05), its value of vicilin / legumin α+β was 2.82 times that of BL. Co heat-induced gel had better quality, and its water holding capacity and hardness were 91.75% and 42.60 g respectively, which were significantly higher than those of BL, PPI and CPI (＜0.05). The microstructure of Co is uniform and dense, and the gel properties of Co are generally superior to those of BL, PPI and CPI, reflecting the synergistic strengthening effect. BL showed antagonistic effect to some extent.【】The heat-induced gels of dual-protein prepared by co-precipitation were superior to those prepared by blending.

dual-protein; co-precipitation; blending; gel properties; pea protein; grass carp protein

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TS254.4

A

1673-9159（2022）03-0079-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.011

2022-02-09

廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（GDOU2016030503）

周小虎（1989―），男，博士研究生，講師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品與豆制品加工。E-mail：foodxiaohu@hnsyu.edu.cn

章超樺（1956―），男，博士，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：zhangch2@139.com

（責(zé)任編輯：劉朏）