鰱蛋白酶解物理化特性及其對(duì)益生菌增殖的影響

黃馨柔，張慧娟，王 凱，羅永康

鰱蛋白酶解物理化特性及其對(duì)益生菌增殖的影響

黃馨柔，張慧娟，王 凱，羅永康

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

【】探究不同酶解方式所得的鰱（）魚肉蛋白酶解物的理化特性及對(duì)鼠李糖乳桿菌（）、動(dòng)物雙歧桿菌（）的潛在益生元活性。分別用復(fù)合酶Ⅰ（中性蛋白酶、堿性蛋白酶活性比1∶1）和復(fù)合酶Ⅱ（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶活性比1∶1∶0.5）水解鰱魚肉，獲取不同酶解時(shí)長(zhǎng)的酶解物，測(cè)定其水解度、分子質(zhì)量分布和感官評(píng)價(jià)，經(jīng)胃腸模擬消化(GID) 處理后添加于培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩種益生菌，測(cè)定培養(yǎng)基的濁度。用復(fù)合酶Ⅱ水解4 h所得鰱魚酶解物的水解度（DH）顯著高于復(fù)合酶Ⅰ（＜0.05），可達(dá)27.2%。感官評(píng)價(jià)分值中，復(fù)合酶Ⅱ酶解產(chǎn)物的苦味分值比復(fù)合酶Ⅰ高。經(jīng)模擬消化后，蛋白肽的小分子肽（＜2 ku）組分比例超過(guò)90%。與空白組相比，該酶解物經(jīng)胃腸模擬消化后按5 g/L劑量添加至益生菌培養(yǎng)基時(shí)，能顯著促進(jìn)益生菌在對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)繁殖（＜0.05）。5 g/L模擬消化產(chǎn)物對(duì)鼠李糖乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖均有促進(jìn)作用，鰱魚肉蛋白酶解物有作為益生元的潛質(zhì)。

鰱；酶解產(chǎn)物；水解度；分子質(zhì)量分布；益生菌

鰱（）是我國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量第二大的魚種[1]，其肉質(zhì)鮮嫩，蛋白含量高，但因肌間刺多、土腥味重等，通常加工為附加值低的魚糜及魚糜制品。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)加工品競(jìng)爭(zhēng)力弱、精深加工比例低[2]。魚類蛋白肽是精深加工的高價(jià)值新型加工品，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。鰱魚肉經(jīng)過(guò)單蛋白酶或多蛋白酶酶解，所得的蛋白肽有不同的生物活性：其蛋白多肽有抗氧化[3]，低溫保護(hù)[4]，調(diào)節(jié)人體血糖[5]、血壓[6]等多種功能，因而有營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑開發(fā)前景。目前，常用益生元多為低聚糖類[7]、多糖類[8]、植物活性物質(zhì)[9]。近年已有蛋白肽益生作用的報(bào)道，如有腸道菌群調(diào)節(jié)作用的蛋清肽[10]、可促進(jìn)羅伊氏乳酸桿菌LR08 ()生長(zhǎng)繁殖的大豆蛋白肽[11]、可特異性增加大鼠腸道內(nèi)鼠李糖乳桿菌（）含量的乳清蛋白肽[12-13]等，因此蛋白肽有被開發(fā)為新型益生元的潛力，但目前對(duì)于鰱蛋白肽的潛在益生元活性研究未見報(bào)道。本研究采用兩種復(fù)合酶酶解鰱魚肉，制備酶解產(chǎn)物，分析酶解產(chǎn)物水解度、感官指標(biāo)及分子質(zhì)量分布，通過(guò)模擬消化方式獲得不同水解物的模擬消化產(chǎn)物，并作用于鼠李糖乳桿菌（）、動(dòng)物雙歧桿菌（），分析模擬消化產(chǎn)物對(duì)益生菌的增殖作用影響，為鰱魚肉蛋白肽的益生活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鰱，購(gòu)自北京健翔橋農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，充氧活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；鼠李糖乳桿菌LGG（）、動(dòng)物雙歧桿菌Bb12（），由北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司提供；中性蛋白酶（31 890 U/mL，pH 6.40，50 ℃）、堿性蛋白酶（227 980 U/mL，pH 6.40，50 ℃）、風(fēng)味蛋白酶（37 140 U/mL，pH 6.40，50 ℃），購(gòu)于諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。鄰苯二甲醛購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，乙腈購(gòu)于Fisher Scientific。MRS肉湯培養(yǎng)基（De Man Rogosa and Sharpe Broth）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

P4紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；DGU-20A3R(C) 高效液相色譜儀，日本島津公司；TSK gel G2000 SWXL凝膠柱（7.8 mm × 300 mm），日本東曹株式會(huì)社；Supermax 3000FA酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚魚肉酶解產(chǎn)物的制備 取鰱魚片，去皮，用絞肉機(jī)絞碎，將肉、蒸餾水按質(zhì)量比1∶2混合，經(jīng)90 ℃水浴20 min后，得肉糜液。肉糜液在50 ℃、1 g蛋白總酶活性5 000 U的條件下進(jìn)行酶解。復(fù)合酶中各種酶按酶活性比例混合：復(fù)合酶Ⅰ，堿性蛋白酶、中性蛋白酶活性比1∶1；復(fù)合酶Ⅱ，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶活性比1∶1∶0.5。分別在酶解0、15、30、60、120、180、240 min時(shí)取樣，以90 ℃水浴20 min，于4 ℃下靜置12 h，去除上層脂肪，樣品以10 000條件離心10 min，取上清液，凍干，低溫干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 水解度（DH）測(cè)定 參照Spellman等[14]方法測(cè)定DH（%）。配制0.5 mg/mL的蛋白酶解物溶液，將150 μL樣品與3 mL OPA溶液(含0.05 mol/L四硼酸鈉、10 mg/mL十二烷基硫酸鈉、體積分?jǐn)?shù)0.2%-巰基乙醇、0.8 mg/mL鄰苯二甲醛、體積分?jǐn)?shù)2%無(wú)水乙醇）混勻，室溫避光條件下反應(yīng)3 min，于340 nm處測(cè)定光密度值，采用0 ～ 4.0 mmol/L的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算氨基氮含量。

水解度=（-0）/×tot，

其中，為水解后氨基氮濃度（mmol/L），0為水解前氨基氮濃度（mmol/L），為樣品質(zhì)量濃度，tot為樣品肽鍵質(zhì)量摩爾濃度（mmol/g）。

1.3.3 感官評(píng)價(jià) 參照王雨生等[15]方法進(jìn)行。感官評(píng)價(jià)小組由年齡21 ～ 30歲的12名成員組成，評(píng)估根據(jù)水解度挑選出的7種鰱魚肉酶解產(chǎn)物風(fēng)味特征。12名評(píng)價(jià)員對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)評(píng)估，從而確定描述詞。因產(chǎn)品凍干粉復(fù)溶后的溶液顏色會(huì)影響感官評(píng)價(jià)結(jié)果，故溶液顏色一并評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 鰱魚魚肉酶解產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4 分子質(zhì)量分布測(cè)定 參照Qin等[16]方法進(jìn)行。用高效液相色譜測(cè)定鰱魚肉酶解產(chǎn)物及其模擬消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量。流動(dòng)相為含體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸和體積分?jǐn)?shù)45%乙腈的超純水，樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL，進(jìn)樣前由孔徑0.22 μm濾膜過(guò)濾，分析柱型號(hào)TSK gel G2000 SWXL（7.8 mm I.D.× 30 cm）。檢測(cè)條件：流動(dòng)相流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量25 μL，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。通過(guò)測(cè)定低聚肽標(biāo)準(zhǔn)品，建立保留時(shí)間與分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 模擬消化 參照Brodkorb等[17]等方法進(jìn)行。取2.0 g樣品，加入2 mL口腔相模擬消化液，于37 ℃水浴震蕩2 min，隨后加入4.0 mL胃相模擬消化液，并用5 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，加入酶活性為16 000 U的胃蛋白酶以模擬胃消化，搖勻，于37 ℃水浴震蕩2 h。胃消化結(jié)束后，加入8.0 mL腸相模擬消化液，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入酶活性為1 600 U的胰蛋白酶及160 mmol的膽鹽，搖勻，于37 ℃水浴震蕩反應(yīng)2 h，沸水浴5 min終止反應(yīng)，產(chǎn)物冰浴冷卻，凍干保存。

表2 胃腸模擬消化液主要組分終濃度

1.3.6 益生菌菌種的前期活化 活化培養(yǎng)基為MRS肉湯培養(yǎng)基（de Man Rogosa and Sharpe Broth），主要成分：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，吐溫80 1 ml/L，磷酸氫二鉀2g/L，酵母浸粉4 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸錳0.05 g/L，乙酸鈉5 g/L，pH 6.2 ± 0.2。

將于-80℃保存的菌種以體積比1%的接種量接種至MRS培養(yǎng)基，于37 ℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行二次傳代，活化12 h，達(dá)到對(duì)數(shù)期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 鰱魚魚肉酶解物的模擬消化產(chǎn)物對(duì)益生菌增殖作用的測(cè)定 空白組培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基。

對(duì)照組培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉以質(zhì)量比10∶5∶4混合，以1、5 g/L添加至MRS肉湯培養(yǎng)基。

酶解產(chǎn)物濃度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：復(fù)合酶I、II酶解4 h的魚肉酶解產(chǎn)物的模擬消化產(chǎn)物（分別記為R2-4、R3-4）以1、5 g/L的劑量添加至MRS肉湯培養(yǎng)基。

酶解時(shí)間實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：復(fù)合酶I、II酶解0.5、2、4 h的魚肉酶解產(chǎn)物的模擬消化產(chǎn)物（分別記為R2-0.5、R2-2、R2-4，R3-0.5、R3-2、R3-4）以5 g/L添加至MRS肉湯培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基均分裝于20mL無(wú)菌厭氧管，以體積比1.0%的接種量分別接種鼠李糖乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌菌液，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，每6 h測(cè)600 nm處光密度值（），對(duì)照樣品是未加菌的培養(yǎng)基。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS v20 進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平為0.05。采用GraphPad Prism 9及Excel 2016繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶解方式下酶解產(chǎn)物的水解度

圖1可見，隨酶解時(shí)間的增加，水解度逐漸增大。這是因?yàn)轸~肉蛋白被酶解成更多的小分子肽段和氨基酸[18]。復(fù)合酶Ⅰ酶解作用在酶解2 h后趨于平緩，而復(fù)合酶Ⅱ的蛋白水解物水解度在2 ～ 4 h仍保持提升，表明風(fēng)味蛋白酶與另外兩種蛋白酶有一定協(xié)同作用，風(fēng)味蛋白酶水解暴露更多氨基酸殘基[19]，促進(jìn)整個(gè)酶解過(guò)程，提高酶解效率。在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)，復(fù)合酶Ⅱ的蛋白水解物水解度均顯著高于復(fù)合酶Ⅰ（＜0.05），表明風(fēng)味蛋白酶的加入對(duì)于鰱魚肉蛋白的酶解有顯著促進(jìn)作用，可能是因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶有不同的酶切位點(diǎn)，使復(fù)合酶Ⅱ更適應(yīng)于與鰱魚肉蛋白結(jié)構(gòu)的酶切位點(diǎn)結(jié)合[20]，對(duì)鰱魚肉的水解作用更為有效[21]。熊思佳等[22]利用復(fù)合酶酶解鰱魚肉4 h的水解度為29.30%，與本研究復(fù)合酶Ⅱ結(jié)果相近。

不同大寫字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，不同小寫字母表示組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

2.2 酶解產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)

圖2可見，復(fù)合酶Ⅱ酶解產(chǎn)物粉末顏色較復(fù)合酶Ⅰ更深，對(duì)應(yīng)溶液也更渾濁更偏黃，這是由于魚肉中含有一定量的糖原，在50℃長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)下，產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物顏色變深[23]。其中復(fù)合酶Ⅱ酶解4 h的酶解產(chǎn)物除苦味外，其他指標(biāo)值均最低，表明長(zhǎng)時(shí)間多酶酶解會(huì)引起酶解物及其溶液的顏色變黃、魚腥味增加，降低感官接受程度。相同酶解時(shí)間時(shí)，復(fù)合酶Ⅱ的酶解產(chǎn)物苦味比復(fù)合酶Ⅰ更輕，這可能是由于不同酶解條件可能產(chǎn)生不同的多肽或氨基酸產(chǎn)物，產(chǎn)生的苦味肽和游離氨基酸含量也不同，進(jìn)而感官感受不同[24]。另一方面，由于風(fēng)味蛋白酶的加入可減少苦味肽的生成[25]，加入風(fēng)味蛋白酶酶解的魚肉可釋放風(fēng)味小分子肽，產(chǎn)生獨(dú)特的香味[26]，從而降低感官上的苦味，增進(jìn)水解物的風(fēng)味。苗曉丹等[27]對(duì)暗紋東方鲀（）肌肉呈味肽的感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，風(fēng)味蛋白酶酶解魚肉蛋白能降低酶解產(chǎn)物的苦味，與本研究結(jié)果一致。

R0，未加酶鰱魚肉蛋白；R2-0.5、R2-2、R2-4，復(fù)合酶Ⅰ酶解0.5、2、4 h的酶解產(chǎn)物；R3-0.5、R3-2、R3-4，復(fù)合酶Ⅱ酶解0.5、2、4 h的酶解產(chǎn)物

2.3 酶解產(chǎn)物及其模擬消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量

圖3(A)表明，未酶解的鰱魚肉蛋白大于10 ku的組分有50%以上，多為肌原纖維蛋白和肌漿蛋白[3]。在兩種不同復(fù)合酶酶解后，大分子蛋白被酶解成小分子肽，大于10 ku組分比例在酶解0.25 h時(shí)大幅度減少，酶解4 h時(shí)僅為0.6%。水解物中小于2 ku組分隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)占比逐漸增加，并趨于平穩(wěn)，最終兩種復(fù)合酶解在酶解4 h時(shí)小于2 ku的比例均高于80%，說(shuō)明在水解度超過(guò)13%時(shí)，魚肉中大部分蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下水解成小分子肽，故小于2 ku的組分比例增加。復(fù)合酶Ⅱ酶解產(chǎn)物中小于0.5 ku肽段的比例比復(fù)合酶Ⅰ多10%以上，可見兩種復(fù)合酶均可有效酶解鰱魚肉蛋白，且參與酶解的酶種類越多，酶解效果越佳。此外，復(fù)合酶Ⅰ和復(fù)合酶Ⅱ的酶解產(chǎn)物中小分子比例變化趨勢(shì)與水解度變化趨勢(shì)一致[28-29]。

由于在模擬消化過(guò)程中添加了胃蛋白酶和胰蛋白酶，對(duì)蛋白肽進(jìn)一步水解。圖3(B) 表明，經(jīng)過(guò)模擬胃相和腸相2 h的反應(yīng)，大分子肽（＞2 ku）組分進(jìn)一步水解，模擬消化后酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量進(jìn)一步減小，小于2 ku的組分比例均超過(guò)90%，且隨著酶解時(shí)間的增加而增加。分子質(zhì)量0.5 ～1.0 ku的組分在模擬消化前后變化不明顯，尤其是酶解時(shí)間較高的組（3 h和4 h組），表明在長(zhǎng)時(shí)間水解后再進(jìn)行模擬消化，鰱魚蛋白肽分子質(zhì)量組分變化不明顯，可能有一定的抗消化特性[30]。

圖3 鰱魚魚肉酶解產(chǎn)物模擬消化前和消化后的分子質(zhì)量分布

2.4 酶解產(chǎn)物濃度對(duì)益生菌增殖的影響

表3表明，二對(duì)照組間6 ～ 24 h內(nèi)濁度均無(wú)顯著差異（＞0.05）。培養(yǎng)基濁度可反映益生菌增殖情況，濁度越高則同體積下菌濃度越高，在相同培養(yǎng)時(shí)間下菌數(shù)量越多則細(xì)菌增殖效果越佳[31]。二對(duì)照組間濁度差異不顯著表明額外添加氮源對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖無(wú)影響。這是由于對(duì)照組添加的氮源組分及其比例與MRS培養(yǎng)基相同，減小了不同蛋白組分的增菌效果不同帶來(lái)的影響[32]。培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中添加5 g/L酶解產(chǎn)物在培養(yǎng)12 h時(shí)濁度顯著高于空白組和對(duì)照組（＜0.05），但在24 h時(shí)無(wú)顯著差異。復(fù)合酶Ⅰ的酶解產(chǎn)物在添加量5 g/L時(shí)比1 g/L僅在12 h時(shí)有顯著差異（＜0.05）。培養(yǎng)動(dòng)物雙歧桿菌時(shí)，復(fù)合酶Ⅱ的酶解產(chǎn)物添加5 g/L時(shí)與空白組在6、12、24 h有顯著差異（＜0.05），與對(duì)照組在6 h時(shí)有差異（＜0.05）。由于在益生菌生長(zhǎng)中后期，培養(yǎng)基環(huán)境pH下降，培養(yǎng)24 h后菌懸濁液內(nèi)菌總數(shù)達(dá)到飽和，生長(zhǎng)曲線進(jìn)入穩(wěn)定期，抑制了菌的生長(zhǎng)繁殖，故濁度無(wú)顯著差異，而當(dāng)光密度值在0.1 ～ 1.0范圍內(nèi)時(shí)，符合檢測(cè)儀器的敏感范圍[33]，故光密度值在對(duì)數(shù)期有顯著差異。

表3 不同濃度鰱魚肉酶解物的模擬消化產(chǎn)物對(duì)鼠李糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌增殖作用的影響

注：不同小寫字母表示同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)組間具有顯著差異(＜0.05)；R3-4，鰱魚肉采用復(fù)合酶Ⅱ酶解4 h；R2-4，鰱魚肉采用復(fù)合酶Ⅰ酶解4 h。

Notes: different lowercase letters indicate that there are significant differences between groups in the same culture time (< 0.05). R3-4: silver carp fillet was hydrolyzed 4 hours by using mixed protease Ⅱ; R2-4: silver carp fillet was hydrolyzed 4 hours by using mixed protease Ⅰ.

因此，在培養(yǎng)兩種益生菌時(shí)，鰱魚肉酶解產(chǎn)物模擬消化產(chǎn)物5 g/L的添加量增殖效果較佳，即添加5 g/L的酶解產(chǎn)物模擬消化產(chǎn)物對(duì)對(duì)數(shù)期益生菌的增殖有促進(jìn)效果，較一般的蛋白酶解物添加10 ～ 20 g/L[34-36]更有優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明鰱魚肉酶解產(chǎn)物中的肽段會(huì)被益生菌優(yōu)先酶解吸收，作為優(yōu)質(zhì)氮源[37]，促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)繁殖[38]。

2.5 酶解產(chǎn)物酶解時(shí)間對(duì)益生菌增殖的影響

由圖4(A)可見，培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌時(shí)，酶解產(chǎn)物的模擬消化產(chǎn)物在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（6 h）與空白組和對(duì)照組有顯著差異（＜0.05），不同酶解時(shí)間的酶解產(chǎn)物模擬消化產(chǎn)物對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖作用無(wú)顯著差異（＞0.05），但對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶解2、4 h的復(fù)合酶Ⅱ酶解產(chǎn)物模擬消化產(chǎn)物的增殖促進(jìn)作用較復(fù)合酶Ⅰ更佳，表明低分子質(zhì)量比例高及高水解度酶解產(chǎn)物的益生效果更佳，這是由于復(fù)合酶Ⅱ酶解產(chǎn)物組分中含有更多寡肽和游離氨基酸，可為細(xì)胞提供必需氨基酸[39]，直接被益生菌吸收，從而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。而對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌（圖4(B)），酶解產(chǎn)物的模擬消化產(chǎn)物則在6、12 h時(shí)有顯著促進(jìn)增殖作用，但不同酶解時(shí)間間無(wú)顯著差異（＞0.05）。葛俊苗[39]添加3 g/L草魚皮酶解產(chǎn)物培養(yǎng)嗜熱鏈球菌，隨著酶解時(shí)間的增加，(600 nm)先升后降，由于其直接添加酶解產(chǎn)物進(jìn)行培養(yǎng)，與本研究使用模擬消化產(chǎn)物不同。由于模擬消化后產(chǎn)物的水解度和低分子質(zhì)量組分比例高于鰱魚肉酶解產(chǎn)物，大部分多肽被酶解成寡肽和游離氨基酸，其發(fā)揮益生活性的成分含量變化較小，對(duì)益生菌促增殖作用并無(wú)顯著變化。

R2-0.5、R2-2、R2-4，復(fù)合酶Ⅰ酶解0.5、2、4 h的酶解產(chǎn)物模擬消化產(chǎn)物；R3-0.5、R3-2、R3-4，復(fù)合酶Ⅱ酶解0.5、2、4 h的酶解產(chǎn)物模擬消化產(chǎn)物；同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，凡含一個(gè)相同字母則組間無(wú)顯著差異（P > 0.05）

3 結(jié)論

本研究制備鰱魚蛋白肽，復(fù)合酶Ⅱ?qū)桇~肉蛋白的酶解能力更強(qiáng)，可產(chǎn)生水解度更高、小分子肽更多的酶解產(chǎn)物，同時(shí)加入風(fēng)味蛋白酶使酶解產(chǎn)物的苦味更輕，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶解產(chǎn)物凍干粉末色澤更深。添加鰱魚肉酶解產(chǎn)物的模擬消化產(chǎn)物5 g/L時(shí)有顯著的益生元活性（< 0.05），故鰱魚肉蛋白肽有益生元開發(fā)潛力，可提升鰱的經(jīng)濟(jì)效益和利用價(jià)值。

[1] 中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2021.

[2] 李慕菡, 郝瑞姣, 宋香榮. 中國(guó)-秘魯水產(chǎn)品貿(mào)易競(jìng)爭(zhēng)力的比較研究[J]. 中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì), 2019, 37(2): 87-92.

[3] WANG K, HAN L H, HONG H, et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from silver carp muscle hydrolysate after simulated gastrointestinal digestion and transepithelial transport[J]. Food Chemistry, 2021, 342: 128275.

[4] LIU Q J, LIU Y L, YU J, et al. Identification and characterization of cryoprotective peptides extracted from silver carp () hydrolysates[J]. International Journal of Food Properties, 2019, 22(1): 1011-1023.

[5] HONG H, ZHENG Y Y, SONG S J, et al. Identification and characterization of DPP-IV inhibitory peptides from silver carp swim bladder hydrolysates[J]. Food Bioscience, 2020, 38: 100748.

[6] ZHANG Y Q, LIU H G, HONG H, et al. Purification and identification of dipeptidyl peptidase IV and angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from silver carp () muscle hydrolysate[J]. European Food Research and Technology, 2019, 245(1): 243-255.

[7] 胡皓程. 黑木耳寡糖的提取、結(jié)構(gòu)表征及生物活性研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2021.

[8] ZEYNEB H, PEI H R, CAO X L, et al.study of the effect of quinoa and quinoa polysaccharides on human gut microbiota[J]. Food Science & Nutrition, 2021, 9(10): 5735-5745.

[9] 章萍萍. 紫薯花青素的提取、純化及其抗氧化和益生元活性研究[D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學(xué), 2017.

[10] GE H F, CAI Z Z, CHAI J L, et al. Egg white peptides ameliorate dextran sulfate sodium-induced acute colitis symptoms by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines and modulation of gut microbiota composition[J]. Food Chemistry, 2021, 360: 129981.

[11] ZHANG C, XIA S Q, ZHANG Y X, et al. Identification of soybean peptides and their effect on the growth and metabolism ofLR08[J]. Food Chemistry, 2022, 369: 130923.

[12] BARTKIENE E, LELE V, SAKIENE V, et al. Improvement of the antimicrobial activity of lactic acid bacteria in combination with berries/fruits and dairy industry by-products[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(8): 3992-4002.

[13] KAREB O, CHAMPAGNE C P, JEAN J, et al. Effect of electro-activated sweet whey on growth of,, andstrains under model growth conditions[J]. Food Research International (Ottawa, Ont), 2018, 103: 316-325.

[14] SPELLMAN D, MCEVOY E, O’CUINN G, et al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2003, 13(6): 447-453.

[15] 王雨生, 冷云, 陳海華, 等. 黃鰭金槍魚皮膠原肽酶解工藝及抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2015, 15(2): 72-78.

[16] QIN X Y, XU Y G, WEI Y, et al. Effects of topical application of different molecular weight marine fish skin collagen oligopeptides on UVB-induced photoaging rat skin[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2021. 1-10. https://doi.org/10.1111/jocd.14349.

[17] BRODKORB A, EGGER L, ALMINGER M, et al. INFOGEST staticsimulation of gastrointestinal food digestion[J]. Nature Protocols, 2019, 14 (4): 991-1014.

[18] 張婷婷, 詹妙新, 張賓樂, 等. 牡蠣干酶法制備海鮮調(diào)味基料的研究[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2021, 46(9): 105-111.

[19] 楊麗媛. 堿性蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)特性的研究[D]. 長(zhǎng)春: 東北師范大學(xué), 2015.

[20] 蔡金秀, 夏姍姍, 馬佳雯, 等. 馬面魚皮膠原抗氧化肽的分離制備及穩(wěn)定性研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2021, 35(11): 2569-2577.

[21] 夏天晴, 李晨豪, 李在祿, 等. 蛋白酶法制備低苦味低分子量南極磷蝦蛋白肽混合物初探[J]. 齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 35(2): 21-27.

[22] 熊思佳, 王發(fā)祥, 俞健, 等. 鰱魚酶解產(chǎn)物對(duì)酵母菌的抗凍保護(hù)作用[J]. 食品與機(jī)械, 2018, 34(2): 116-119.

[23] 劉平. 美拉德肽的形成機(jī)理及功能特性研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2012.

[24] 鄭瑞生, 林雅萍, 孫秋瓊, 等. 酶解馬鮫魚下腳料制備海鮮醬工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2021, 37(6): 201-206.

[25] FU Y, LIU J, HANSEN E T, et al. Structural characteristics of low bitter and high umami protein hydrolysates prepared from bovine muscle and porcine plasma[J]. Food Chemistry, 2018, 257: 163-171.

[26] 張耀, 張露, 劉俊, 等. 青魚肉活性肽的制備及其抗腫瘤活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2021, 47(5): 35-42.

[27] 苗曉丹, 劉源, 馬壘, 等. 結(jié)合感官評(píng)價(jià)與電子舌技術(shù)優(yōu)化酶水解養(yǎng)殖暗紋東方鲀肌肉制備呈味肽[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(8): 268-272.

[28] 蘇繼磊, 李姣, 陳敏, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化太平洋褶柔魚肌肉蛋白水解物的抗氧化活性[J]. 食品科技, 2021, 46(6): 121-128.

[29] 張弛. 鳙魚肌肉蛋白肽的制備、分離純化及生物活性的研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018.

[30] 楊玉亮, 衣大龍, 劉春雨, 等. 體外模擬消化對(duì)牦牛骨膠原蛋白肽抗氧化活性的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2021, 47(13): 79-84.

[31] 王麗波, 高婧宇, 李騰飛, 等. 硒化蒲公英多糖的制備、結(jié)構(gòu)表征及益生菌促增殖活性[J]. 食品科學(xué), 2021, 42(7): 169-175.

[32] 王智鼎, 劉艷秋, 李岳飛, 等. 鼠李糖乳桿菌GG(LGG)高密度培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 食品科技, 2013, 38(11): 8-11.

[33] 李恪梅, 魏東, 王秉翔, 等. 人用布氏菌疫苗濃度測(cè)定分光光度法的建立[J]. 中國(guó)藥事, 2011,25(3): 233-235.

[34] YU Y J, AMORIM M, MARQUES C, et al. Effects of whey peptide extract on the growth of probiotics and gut microbiota[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 21: 507-516.

[35] 劉峰, 涂強(qiáng), 袁學(xué)賓, 等. 玉米肽對(duì)益生菌增殖作用的研究[J]. 飼料研究, 2020, 43(11): 68-72.

[36] 胡凌豪. 鳳尾魚酶解產(chǎn)物對(duì)嗜熱鏈球菌增殖作用及其生物活性研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2019.

[37] DIETHER N E, WILLING B P. Microbial fermentation of dietary protein: an important factor in Diet?Microbe?Host interaction[J]. Microorganisms, 2019, 7(1): 19.

[38] LAZZI C, MELI F, LAMBERTINI F, et al. Growth promotion ofandspecies by proteinaceous hydrolysates derived from poultry processing leftovers[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2013, 48(2): 341-349.

[39] 葛俊苗. 草魚皮酶解工藝優(yōu)化及產(chǎn)物促進(jìn)嗜熱鏈球菌增殖和抗氧化性研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2019.

Physicochemical Properties and Potential Prebiotic Activity of Silver Carp () Protein Hydrolysates

HUANG Xin-rou, ZHANG Hui-juan, WANG Kai, LUO Yong-kang

(,,100083,)

【】 To investigate physicochemical properties and potential prebiotic activity of silver carp (protein hydrolysates onand.【】 Silver carp fillet was hydrolyzed respectively by mixed proteasesⅠ (enzyme activity ratio of neutrase to alcalase is 1∶1) and Ⅱ (enzyme activity ratio of neutrase to alcalase and flavourzyme is 1∶1∶0.5) for different durations of time. The degree of hydrolysis (DH), molecular mass and sensory evaluation of the hydrolysates were determined. The hydrolysates were submitted togastrointestinal digestion (GID) and the digested products were collected to cultureand, and the turbidity of the culture medium was measured. 【】 The DH of silver carp hydrolysates hydrolyzed by mixed protease Ⅱ was significantly higher than those hydrolyzed by mixed proteasesⅠ(< 0.05), with the maximum at 27.2%. In sensory evaluation, hydrolysates of mixed proteaseⅠ were bitter than that by mixed protease Ⅱ. The component of low molecular mass peptide (＜2 ku) of silver carp hydrolysates afterGID is more than 90%. Compared with the control group (MRS medium), the concentration of 5 g/L of digestion products can promote the growth of probiotics in logarithmic phase significantly (< 0.05). 【】5 g/L of digestion products could promote the proliferation ofand, which indicated that silver carp protein hydrolysates had the potential to be a prebiotics.

; enzymatic hydrolysates; degree of hydrolysis; molecular mass distribution; probiotics

黃馨柔，張慧娟，王凱，等. 鰱蛋白酶解物理化特性及其對(duì)益生菌增殖的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（3）：72-78.

TS254.4

A

1673-9159（2022）03-0072-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.010

2021-12-02

財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助(CARS-45)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)課題（2017YFD0400201）

黃馨柔（1997―），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail:18811720833@163.com

羅永康，男，博士，教授，研究方向水產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：luoyongkang@cau.edu.cn

（責(zé)任編輯：劉慶穎）