狼瘡性腎炎患者血漿巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)水平及其臨床意義

崔艷，齊媛媛，劉欣冉，趙亞飛，趙占正

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種全身性自身免疫性疾病，多發(fā)生于育齡期女性，病變可累及全身各個(gè)系統(tǒng)或器官。腎是SLE最主要累及的器官之一，其受累也是SLE患者生活質(zhì)量受到影響以及死亡的最主要原因［1-2］。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是我國(guó)較為常見的繼發(fā)性腎病，約90%以上的SLE患者均有不同程度的腎損害，10%～30%的患者可能會(huì)進(jìn)展至終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）［3］。目前，腎穿刺活檢術(shù)仍然是診斷SLE腎損害的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找一種能夠及時(shí)預(yù)測(cè)LN發(fā)生的新型生物標(biāo)志物對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）是一種主要負(fù)責(zé)巨噬細(xì)胞的生存、增殖和活化的細(xì)胞因子，既往已有研究證實(shí)活化的促炎性巨噬細(xì)胞可能會(huì)促進(jìn)SLE患者發(fā)生腎損害，并且還會(huì)加重LN的病情［4］。作為其激活過程中必不可少的細(xì)胞因子，之前也有研究顯示血清MCSF水平在SLE患者中升高，并且與疾病的活動(dòng)性有關(guān)［5］。本研究通過對(duì)SLE是否合并腎損害進(jìn)行嚴(yán)格篩選，探討MCSF在SLE患者不合并腎損害與合并腎損害中的表達(dá)差異及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，從而進(jìn)一步驗(yàn)證MCSF是否可作為預(yù)測(cè)LN的發(fā)生以及病情進(jìn)展的一種可靠的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究為一項(xiàng)橫斷面研究。選取2019年9月至2020年1月就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的SLE患者。SLE合并腎損害的判斷依據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的腎損害標(biāo)準(zhǔn)［6］，即：24小時(shí)尿蛋白定量持續(xù)≥0.5 g或尿蛋白定性≥+++或尿中有細(xì)胞管型；持續(xù)存在尿蛋白與肌酐比值（urinary protein to creatinine ratio，uPCR）≥0.5；排除感染后仍存在活動(dòng)性尿沉渣；腎穿刺活檢證實(shí)有腎損傷的存在。為確保結(jié)果的可靠性，本研究為不合并腎損害的SLE患者制定了嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)，如有以下任意一項(xiàng)則被排除：（1）尿蛋白定性≥+；（2）24小時(shí)尿蛋白定量或uPCR高于正常范圍上限；（3）排除尿路感染后，仍合并血尿、膿尿或管型尿；（4）血肌酐（serum creatinine，Scr）高于正常范圍上限。最終，本研究收集的血漿樣本共來自76例患者，根據(jù)是否合并腎損害分為SLE組（16例）和LN組（60例）。同時(shí)，招募了21例健康志愿者作為對(duì)照組。98例全血樣本來自待測(cè)血漿樣本的試驗(yàn)對(duì)象（SLE組16例，LN組53例，對(duì)照組21例）以及新納入組的8例（SLE 1例，LN 4例，對(duì)照者3例），故全血樣本共包括：SLE組17例，LN組57例以及對(duì)照組24例。7例LN患者腎組織標(biāo)本取自在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科接受腎穿刺活檢術(shù)的患者，4例對(duì)照組標(biāo)本取自在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療的腎癌患者的遠(yuǎn)端正常腎組織。本研究已獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理獲批編號(hào)：2019-KY-134）。所有入組的試驗(yàn)對(duì)象均同意本研究對(duì)樣本的采集與處理，并簽署知情同意書。

1.2 一般資料收集入選人群的性別、年齡等人口學(xué)資料，SLE患者的臨床表現(xiàn)，如面部紅斑、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎等，實(shí)驗(yàn)室資料，包括收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)（platelets，PLT），uPCR、尿素、Scr、尿酸（uric acid，UA）、估算腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血清補(bǔ)體C3及C4水平、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應(yīng)蛋白、抗dsDNA抗體等。同時(shí)收集所有接受過腎穿刺活檢術(shù)的LN患者的病理分型、活性指數(shù)（activity index，AI）及慢性指數(shù)（chronic index，CI）。SLE活動(dòng)性評(píng)分依據(jù)2000年系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血漿MCSF測(cè)定 抽取76例入組患者及21例健康人的外周靜脈血5 mL，裝于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，分離出血漿樣本后密封凍存于-80℃冰箱內(nèi)。應(yīng)用人細(xì)胞因子芯片定量檢測(cè)試劑盒（Raybiotech）檢測(cè)所有血漿樣本的MCSF水平。

1.3.2 全血及腎組織MCSF mRNA表達(dá)測(cè)定 抽取74例患者及24例健康人的外周靜脈血，使用TRIzol試劑（Life Technologies）從全血樣本中分離和提取總RNA，并且應(yīng)用PE150（Illumina，San Diego，CA，USA）進(jìn)行全基因組RNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)（RNA sequencing，RNAseq）以檢測(cè)全血MCSF mRNA的表達(dá)水平。此外，利用RNA-seq技術(shù)分別檢測(cè)7例LN患者腎組織標(biāo)本及4例對(duì)照組腎組織標(biāo)本中MCSF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)及四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。血漿MCSF水平與疾病活動(dòng)性及腎功能等的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料特點(diǎn)本研究共納入16例不伴腎損害的SLE患者、60例LN患者及21例對(duì)照者用于分析血漿MCSF水平的表達(dá)差異。3組中女性占比分別為87.5%、88.3%和66.7%，年齡中位數(shù)分別29.5、30和25歲。相對(duì)于SLE組，LN組患者面部紅斑發(fā)生率稍低，血壓、尿素、Scr及UA水平較高，血清白蛋白和eGFR水平較低（P＜0.05）。兩組其他資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 患者的一般資料

2.2 血漿MCSF表達(dá)水平LN組、SLE組及對(duì)照組血漿MCSF水平分別為0.44（0～3.64）、0（0～0.44）ng·L-1及0。與SLE組及對(duì)照組相比，LN組血漿MCSF表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SLE組與對(duì)照組血漿MCSF表達(dá)水平相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 3組血漿MCSF表達(dá)水平比較

2.3 血漿MCSF水平與LN臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性LN組患者血漿MCSF水平特異性升高，以LN患者中血漿MCSF水平的中位數(shù)0.439為界，將LN患者分為兩組，即高血漿MCSF組和低血漿MCSF組。與低血漿MCSF組相比，高M(jìn)CSF組LN患者的漿膜炎發(fā)生率更高（P＝0.028），高M(jìn)CSF組患者的PLT水平、血清C3及C4水平較低，且高M(jìn)CSF組患者的基線腎功能較差，即血尿素氮、Scr水平較高，eGFR水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組關(guān)節(jié)炎發(fā)生率及血淋巴細(xì)胞、血清UA、ESR、C反應(yīng)蛋白以及抗dsDNA抗體水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究共收集到60例LN患者的腎穿刺病理結(jié)果，兩組膜型（Ⅱ或Ⅴ型）、增殖型（Ⅲ或Ⅳ型）、混合型（Ⅴ、Ⅲ型或Ⅴ、Ⅳ型）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。采用Spearman相關(guān)性分析進(jìn)一步研究血漿MCSF水平與LN患者部分指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，血漿MCSF水平與LN患者發(fā)生漿膜炎有關(guān)，即血漿MCSF水平越高，LN患者發(fā)生漿膜炎的可能性越大（P＝0.032）。LN患者血漿MCSF水平與PLT、C3、C4水平呈負(fù)相關(guān)（r＜0，P＜0.05），與SLEDAI評(píng)分（r＞0，P＜0.05）呈正相關(guān)；血漿MCSF水平與LN患者uPCR、血尿素、Scr呈正相關(guān)（r＞0，P＜0.05），與eGFR呈負(fù)相關(guān)（r＜0，P＜0.05）。見表3。

表2 高M(jìn)CSF組與低MCSF組臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

表3 LN患者M(jìn)CSF水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 全血及腎組織MCSF mRNA表達(dá)差異LN組全血MCSF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.040）。LN組與SLE組以及SLE組與對(duì)照組的MCSF mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，與對(duì)照組相比，LN組腎組織MCSF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平較高（P＝0.006）。見圖2。

圖2 全血及腎組織MCSF mRNA相對(duì)表達(dá)差異比較

3 討論

LN是我國(guó)較為常見的繼發(fā)性腎病，也是ESRD主要病因之一。腎炎癥反應(yīng)的發(fā)生也是LN發(fā)病的重要原因之一［7］。正常情況下，機(jī)體巨噬細(xì)胞作為人體固有免疫重要組成部分，主要發(fā)揮吞噬異物及死亡細(xì)胞、清除有害物質(zhì)等生理作用以維持人體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。而在機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)下，被異常激活的腎內(nèi)巨噬細(xì)胞則介導(dǎo)腎損害的發(fā)生和病情的持續(xù)進(jìn)展［8-9］。已有研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞參與了SLE的病理過程，且異常增殖活化的巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)MRL-Faslpr大鼠疾病進(jìn)展［10-11］。MCSF是一種參與巨噬細(xì)胞增殖、活化的重要的細(xì)胞因子。早期識(shí)別SLE患者腎損害的發(fā)生對(duì)延緩病情進(jìn)展、改善腎預(yù)后具有重要意義［12］。但是，作為一項(xiàng)有創(chuàng)性操作，臨床腎穿刺活檢術(shù)可能會(huì)因?yàn)榛颊吆喜⑵渌喜Y、費(fèi)用高昂或患者個(gè)人原因不能有效配合而無法順利實(shí)施。因此，仍需要一些新型且可靠的生物標(biāo)志物用于監(jiān)測(cè)SLE患者腎損害的發(fā)生及疾病活動(dòng)性。

本研究檢測(cè)了MCSF在SLE及LN患者中的表達(dá)水平，詳細(xì)研究了MCSF與SLE合并LN患者病情活動(dòng)性及嚴(yán)重性的相關(guān)性。與之前研究結(jié)果［5，13］一致，本研究顯示LN患者血漿MCSF水平升高。研究表明，MCSF主要表達(dá)于腎小管內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)腎發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，腎內(nèi)MCSF表達(dá)增加導(dǎo)致腎間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞大量聚集、活化，并向促炎型轉(zhuǎn)化，從而引起腎損傷，同時(shí)腎內(nèi)增加的MCSF也會(huì)釋放入血，引起循環(huán)MCSF水平升高［14-15］。此外，本研究結(jié)果顯示，血漿MCSF水平與LN患者血小板水平、血清補(bǔ)體水平以及SLEDAI評(píng)分都有相關(guān)性。既往研究表明，血清補(bǔ)體水平與SLE患者病情活動(dòng)有關(guān)［16］，而SLEDAI評(píng)分是臨床上常用來評(píng)價(jià)SLE病情活動(dòng)程度的指標(biāo)。病情持續(xù)高活動(dòng)狀態(tài)是SLE患者死亡及并發(fā)不可逆性器官損害的重要因素［17］。因此，監(jiān)測(cè)疾病活動(dòng)性在治療LN的整個(gè)過程中都具有重要意義。另外，蛋白尿是預(yù)測(cè)患者腎預(yù)后的重要指標(biāo)，持續(xù)大量蛋白尿是患者進(jìn)展至ESRD的主要原因［18］。研究表明，在第12個(gè)月時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白尿小于0.8 g·d-1是LN患者腎長(zhǎng)期預(yù)后良好的預(yù)測(cè)因素［19］。所以，臨床上治療LN的重要目的就是能夠盡早實(shí)現(xiàn)蛋白尿完全緩解。本研究結(jié)果顯示，LN患者血漿MCSF水平與uPCR呈正相關(guān)。此外，本研究結(jié)果表明高血漿MCSF水平患者基線腎功能較差，且MCSF水平與LN患者Scr呈正相關(guān)。而有研究表明，疾病確診時(shí)合并腎功能降低是LN患者長(zhǎng)期腎預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［20］。以上則說明血漿MCSF水平升高還可能與LN患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后不良有一定的關(guān)系。本研究也存在一定的局限性：本研究納入的樣本量較小，可能對(duì)基線資料的比較具有一定的影響；本研究為橫斷面研究，MCSF水平與LN的發(fā)生及遠(yuǎn)期預(yù)后的因果關(guān)系的評(píng)估可能還需要之后長(zhǎng)期隨訪觀察以進(jìn)一步驗(yàn)證；部分患者已經(jīng)接受激素或免疫抑制劑治療，藥物性影響的可能性尚不能排除。

綜上所述，通過檢測(cè)健康人、LN及不伴腎損害的SLE患者的血漿MCSF水平，本研究發(fā)現(xiàn)LN患者血漿MCSF水平升高。高M(jìn)CSF水平的LN患者發(fā)生漿膜炎的可能性更大，基線腎功能更差。此外，MCSF還與LN患者病情活動(dòng)性、尿蛋白水平及腎功能相關(guān)。因此，MCSF或許可以作為一種評(píng)估LN的發(fā)生、監(jiān)測(cè)病情活動(dòng)及腎功能惡化的生物標(biāo)志物。