局部44℃溫?zé)嶂委熂怃J濕疣的效果及對(duì)外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)因子的影響

陳衛(wèi)豐

湖南省益陽(yáng)市中心醫(yī)院皮膚科，湖南益陽(yáng) 413000

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）對(duì)機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能方面起非常重要的作用，如維持免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答等。 研究表明，由人類乳頭瘤病毒（HPV）引起的尖銳濕疣（CA）與其細(xì)胞免疫功能相對(duì)不足密切相關(guān)，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞調(diào)控機(jī)體對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答主要通過(guò)抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞因子分泌，CD4+CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞的局部聚集可能是皮損的CA 實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的機(jī)制之一[1]。近年來(lái)，局部的44℃溫?zé)嶂委煴怀晒Φ貞?yīng)用于不同型別的HPV 感染，可能通過(guò)促進(jìn)朗格漢斯細(xì)胞（LC）的遷移和成熟，在局部細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[2]。本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)檢測(cè)35 例CA 患者在44℃溫?zé)嶂委熐昂驝D4+CD25+Treg 的表達(dá)及在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分化發(fā)育和功能維持中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 以及負(fù)性協(xié)同刺激分子，如程序性死亡分子配體（PD-L）、細(xì)胞毒T 細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）和腫瘤壞死因子受體（GITR）等的表達(dá)水平，以及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞內(nèi)分泌的抑制性細(xì)胞因子白介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的陽(yáng)性細(xì)胞百分比，探討44℃溫?zé)釋?duì)CA 患者機(jī)體免疫功能的影響及可能作用機(jī)制，為溫?zé)嶂委熂怃J濕疣提供新的理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取2013 年1 月～2015 年4 月益陽(yáng)市中心醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診的經(jīng)臨床確診的CA 患者35 例，均無(wú)復(fù)發(fā)性CA 病史，35 例受試者疣體數(shù)目≥5 個(gè)或單個(gè)直徑≥2 cm，符合2000 年原衛(wèi)生部防疫司制訂的CA 診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中男15 例，女20 例；年齡18～60 歲，平均（37.45±10.58）歲；病程0.1～30 個(gè)月，平均（9.63±3.51）個(gè)月。 選取正常人作為對(duì)照組，共35 例，其中男17 例，女18 例，年齡18～58 歲，平均（30.78±9.41）歲。所有研究對(duì)象近2 個(gè)月內(nèi)沒(méi)有使用過(guò)任何免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)藥物，排除全身衰竭、結(jié)核、肝腎疾病、腫瘤、器官移植及其他免疫性疾病。 各組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)其本人或家屬同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法

應(yīng)用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)自主研制的溫?zé)嶂委焹x（專利號(hào)ZL200720185403.3），選取靶疣進(jìn)行局部44℃溫?zé)嶂委煟B續(xù)治療4 d，每次60 min，1 次/d；間隔7～10 d，再連續(xù)治療3 d；間隔7～10 d，再連續(xù)治療2 d；此后每隔7～10 d 進(jìn)行1 次治療，直至疣體消退。 3 個(gè)月時(shí)觀察臨床療效。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑和儀器 CD4-FITC 單克隆鼠抗人抗體，CD25-PE 單克隆鼠抗人抗體及同型對(duì)照IgG1-FITC，IgG1-PE，PD-L-FITC單克隆鼠抗人抗體、CTLA-4（CD152）-PE 單克隆鼠抗人抗體及同型對(duì)照小鼠IgG1、IgG2α抗 體 和PE 標(biāo) 記 的 抗 人Foxp3 胞 內(nèi) 染 色 試劑盒均購(gòu)自eBioscience 公司。 流式細(xì)胞儀為Beckman公司產(chǎn)品（型號(hào)：EPICS-XL）。 人IL-10、人TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒為eBiosource 公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液（AXIS-SHIELD 公司）。MagCellectTM人CD4+CD25+Treg 細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒購(gòu)自R&D 公司。

1.3.2 CD4+CD25+T 細(xì)胞的分離純化 用90 μL 緩沖液調(diào)整外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）為1×108/mL，再加入CD25 磁珠標(biāo)記抗人CD25 單抗10 μL，置4℃冰箱孵育15 min，過(guò)MS 柱分選，收集流下來(lái)的細(xì)胞懸液和洗柱液，陽(yáng)性選擇獲得CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，重復(fù)上述操作，以增加細(xì)胞的純度。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，其純度＞85%。

1.3.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞染色 采用淋巴細(xì)胞分離液（AXIS-SHIELD 公司）經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%的小牛血清的培養(yǎng)基RPMI 1640 調(diào)細(xì)胞至1×106/mL，取200 μL 細(xì)胞懸液加入抗CD4-PE、CD25-FITC 單克隆抗體各20 μL，同型對(duì)照分別為IgG1-FITC，IgG1-PE，混勻，室溫避光孵育20～30 min，加2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，4℃，1500 r/min 離心5 min，棄上清，加2%正常大鼠血清100 μL，避光封閉20 min，以減少非特異性熒光吸附，再加入PE 標(biāo)記抗人Foxp3 抗體10 μL，避光孵育20～30 min，加2 mL PBS 緩沖液洗滌2 次，將細(xì)胞懸浮于0.5 mL PBS 洗滌液中，振蕩混勻后上機(jī)檢測(cè)。1.3.4 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞膜分子熒光染色 采用全血熒光抗體直接染色法[3]，取2 管EDTA 抗凝全血100 μL，置12 mm×75 mm 專用塑料試管中， 加入20 μL 特異性熒光單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單抗作為同型對(duì)照，室溫下避光染色15 min。 然后加入溶血素2 mL 溶解紅細(xì)胞、穩(wěn)定和固定白細(xì)胞，靜置5 min，4℃，1500 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 洗滌2 次，最后加入1%多聚甲醛300 μL 固定后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-10 和TGF-β 的檢測(cè) 具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]：取上述凍存PBMC 培養(yǎng)上清， 采用ELISA 法檢測(cè)上清中IL-10和TGF-β 水平，按試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 療效標(biāo)準(zhǔn)

治愈：外陰尖銳濕疣疣體全部脫落，臨床癥狀消失，宮頸HPV-DNA 復(fù)查結(jié)果為陰性。 顯效：宮頸HPV-DNA 復(fù)查結(jié)果為陰性或弱陽(yáng)性，外陰尖銳濕疣疣體脫落70%以上。 無(wú)效：HPV-DNA 復(fù)查結(jié)果為陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，外陰尖銳濕疣疣體無(wú)改變或無(wú)明顯脫落?？傆行?（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。 以3 個(gè)月為治療終點(diǎn)，計(jì)算總有效率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CA 患者經(jīng)局部44℃溫?zé)嶂委? 個(gè)月后，總有效率達(dá)85.71%（30/35），治療中未見(jiàn)明顯副作用。

2.1 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、抑制性膜分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較

CA 組患者CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L 表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（均P ＜0.05）；CA 組患者IL-10及TGF-β 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組明顯增多（均P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、抑制性分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（±s）

表1 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、抑制性分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（±s）

注：CA：尖銳濕疣；CTLA-4：細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原4；GITR：腫瘤壞死因子受體；PD-L：程序性死亡分子1 配體；IL-10：白細(xì)胞介素-10；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

組別 例數(shù) CD4+CD25+Treg 細(xì)胞（%） CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞（%） CTLA-4 GITR PD-L IL-10 TGF-β對(duì)照組CA 組t 值P 值35 35 10.5±1.8 15.2±2.3 9.52＜0.05 5.8±1.4 13.1±2.5 15.07＜0.05 1.2±0.4 3.2±1.3 8.63＜0.05 8.6±1.6 13.2±2.5 9.16＜0.05 1.4±0.5 2.3±0.9 10.92＜0.05 0.47±0.13 0.60±0.20 3.22＜0.05 0.15±0.06 0.32±0.13 7.02＜0.05

2.2 治療前后CA 患者外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、抑制性膜分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

治療后外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、CTLA-4、GITR、PD-L 水平及IL-10、TGF-β 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較治療前顯著下降（均P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

大量研究表明，免疫系統(tǒng)在人乳頭瘤病毒引起的相關(guān)疾病結(jié)局上起重要作用，HPV 持續(xù)感染的重要機(jī)制是全身或局部細(xì)胞免疫功能缺陷，病損局部主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ和MHCⅡ分子的下調(diào)，導(dǎo)致惡性變[1-4]。近年隨著對(duì)CD4+CD25+Treg 各種生物學(xué)特性和功能的進(jìn)一步研究，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面表達(dá)CD25、CTLA-4、GITR 和PD-L 等膜分子，其特征性的分子標(biāo)記是Foxp3+，發(fā)現(xiàn)HPV 感染很可能存在Treg 異常，如HPV 病損局部可有CD4+CD25+Foxp3+Treg 高表達(dá)，也不具有MHC 限制性，主要通過(guò)細(xì)胞間直接接觸和分泌抑制性膜分子IL-10 和TGF-β 發(fā)揮免疫抑制功能，免疫抑制環(huán)境主要由局部低表達(dá)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ 和TGF-β、IL-10 高表達(dá)形成。CD4+CD25+Treg 細(xì)胞是一種新型免疫抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞，機(jī)體對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答主要通過(guò)抑制增殖效應(yīng)細(xì)胞和分泌細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)可能在CA 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5]，提示刺激HPV 發(fā)生特異性免疫反應(yīng)可通過(guò)抑制或去除Treg 細(xì)胞來(lái)達(dá)成，從而抑制HPV 的持續(xù)慢性感染。隨著熱療技術(shù)的相關(guān)原理研究進(jìn)一步深入，以及對(duì)溫度測(cè)定、控制和加熱技術(shù)的不斷進(jìn)步，熱療技術(shù)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。 近年來(lái)，溫?zé)岜粡V泛應(yīng)用于各種病毒疣的治療，并且取得了良好的療效，但其具體的作用機(jī)制尚不明了[6-7]。 有研究表明，44℃溫?zé)崮軌虼龠M(jìn)LC 成熟、遷移，并且增強(qiáng)其抗原提呈能力，LC能通過(guò)真皮層向局部淋巴結(jié)遷移，誘導(dǎo)病毒疣局部細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，從而對(duì)病毒感染引起的病毒疣發(fā)揮有效作用[8-9]。

表2 治療前后CA 患者外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、抑制性分子及細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（±s）

表2 治療前后CA 患者外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞、抑制性分子及細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（±s）

注：CA：尖銳濕疣；CTLA-4：細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原4；GITR：腫瘤壞死因子受體；PD-L：程序性死亡分子1 配體；IL-10：白細(xì)胞介素-10；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

時(shí)間 例數(shù) CD4+CD25+Treg 細(xì)胞（%） CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞（%） CTLA-4 GITR PD-L IL-10 TGF-β治療前治療后t 值P 值35 35 15.2±2.3 11.2±2.0 7.76＜0.05 13.1±2.5 6.5±1.7 12.91＜0.05 3.2±1.3 1.4±0.5 7.46＜0.05 13.2±2.5 9.2±1.8 7.68＜0.05 2.3±0.9 1.6±0.6 9.29＜0.05 0.60±0.20 0.50±0.10 2.64＜0.05 0.32±0.13 0.17±0.07 6.01＜0.05

本研究結(jié)果表明，CA 患者CD4+CD25+Treg 細(xì)胞、 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L 表達(dá)均比對(duì)照組顯著增高 （P ＜0.05）；CA 組CD4+CD25+T 細(xì)胞內(nèi)分泌IL-10 及TGF-β 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組明顯增多， 說(shuō)明機(jī)體免疫功能受到明顯抑制，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞及相關(guān)因子共同參與了尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展，CA 患者高表達(dá)CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞數(shù)，可誘導(dǎo)其增殖活化，同時(shí)高表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號(hào)的負(fù)性協(xié)同刺激分子CTLA-4、GITR 及PD-L， 其表達(dá)水平可以反映Treg 細(xì)胞功能的強(qiáng)弱，通過(guò)某種機(jī)制抑制機(jī)體免疫功能的影響，這在尖銳濕疣發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10]。 也有學(xué)者指出，Treg 細(xì)胞可以通過(guò)直接接觸和分泌抑制性因子IL-10及TGF-β 發(fā)揮免疫抑制和感染耐受的雙重作用[11]。尖銳濕疣發(fā)生及持續(xù)感染的重要機(jī)制之一在于機(jī)體不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用[12]，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞通過(guò)抑制CD4+和CD8+細(xì)胞的IL-2 基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來(lái)抑制T 細(xì)胞的活化增殖， 使局部微環(huán)境處于免疫抑制或耐受狀態(tài)，F(xiàn)oxp3+Treg 細(xì)胞通過(guò)TGF-β 在促進(jìn)自身增殖分化同時(shí)抑制Th1和Th2分化，從反向抑制了機(jī)體局部抗病毒免疫應(yīng)答[13]，形成尖銳濕疣持續(xù)感染， 促進(jìn)了尖銳濕疣生長(zhǎng)和發(fā)展。有研究表明，CA 患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞含量明顯增高，且復(fù)發(fā)患者顯著高于初發(fā)患者，提示尖銳濕疣患者存在有一定程度上病毒特異性細(xì)胞免疫受損， 而細(xì)胞免疫功能水平直接影響尖銳濕疣HPV 感染的病程及其疾病的轉(zhuǎn)歸，通過(guò)抑制或去除Treg 細(xì)胞來(lái)刺激HPV 特異性免疫反應(yīng)，從而抑制HPV慢性感染[14]。 局部44℃溫?zé)嶂委? 個(gè)月，治愈率達(dá)85.71%， 治療中未見(jiàn)明顯副作用， 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞數(shù)量、CTLA-4、GITR、PD-L、IL-10 和TGF-β 水平顯著下降（P ＜0.05），表明溫?zé)崮軌蛴行е委烪PV 感染尖銳濕疣病，這可能與協(xié)助增強(qiáng)機(jī)體免疫功能有關(guān)。 溫?zé)嶂委燄囿w的說(shuō)法不一，有些研究者認(rèn)為病灶組織與正常組織相比， 對(duì)溫?zé)岣舾衃15]，熱損傷后更不易恢復(fù)[16]，有些則推測(cè)可能是溫?zé)嵋鸩∽兘M織壞死。 研究發(fā)現(xiàn)，44℃溫?zé)嶂委熂怃J濕疣病后， 機(jī)體可抑制CD4+CD25+Treg 細(xì)胞增殖活化，負(fù)性調(diào)節(jié)刺激分子CTLA-4、GITR、PD-L 以及抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β，推測(cè)其機(jī)制可能為促進(jìn)了局部免疫調(diào)節(jié)作用，引起靶疣局部LC 向附近淋巴結(jié)遷移和增強(qiáng)抗原提呈功能，從而促成特異性免疫應(yīng)答的建立， 破除由局部高表達(dá)IL-10 和TGF-β 形成的免疫抑制環(huán)境，抑制免疫逃逸機(jī)制以清除HPV 病毒[2，17]。

綜上所述，本研究認(rèn)為，44℃溫?zé)嶂委熂怃J濕疣具有較好的臨床療效，能有效調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，其治療機(jī)制可能與調(diào)節(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞及相關(guān)分子有關(guān)，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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