UV-B 輻射強度對鳶尾葉關(guān)鍵酶活性的分析

李 瑩，何順武，曹 平

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054;2.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴陽 550025)

0 引言

鳶尾(Iris)，又名紫蝴蝶、藍蝴蝶、烏鳶，是一種生態(tài)分布極為廣泛、種類繁多、富含酶系統(tǒng)的綠色植物［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》［2］指出鳶尾葉中含有抗炎消腫、鎮(zhèn)痛收斂、止血散淤、消化不良等功效的碳酸酚和抗病毒作用的黃酮，有較高的藥用價值［3-9］。正常條件下，植物細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活性的產(chǎn)生和釋放處于動態(tài)平衡模式，關(guān)鍵酶可將有毒物質(zhì)氧化成無毒物質(zhì)，對植物體起保護作用，但隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，氯氟烴類和氯化氮等化學(xué)物質(zhì)的大量排放嚴重損壞了臭氧層結(jié)構(gòu)，平流層臭氧的減薄促使UV-B(280～320 nm)輻射增強，導(dǎo)致自由基不斷積累，逐漸降低了綠色植物關(guān)鍵酶的活性，對植物的正常生長、代謝和基因轉(zhuǎn)變等造成嚴重影響，已成為了備受關(guān)注的熱點問題［10-19］。

UV-B 輻射是影響植物生長的一項指標，它可能改變植物的高度和葉面積，同種植物在UV-B 輻射增強下，植株在形態(tài)方面呈現(xiàn)不同的變化，從而改變種間的相互關(guān)系，生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能也會改變。近年的一些研究表明，UV-B 輻射會影響抗壞血酸過氧化物酶(APX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。當(dāng)植物受到脅迫時，植物細胞中控制物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶首先做出反應(yīng)。APX、PAL、GR 是植物代謝過程的3種關(guān)鍵酶，與植物的抗性密切相關(guān)［20-28］。本實驗通過對鳶尾葉片進行UV-B 輻射處理，利用紫外可見分光光度法測定3 種不同UV-B 輻射強度條件下，APX、PAL、GR 酶的活性變化情況，探究酶活性在輻射強度和輻射時間下的影響。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

鳶尾葉片，采自貴州大學(xué)民族學(xué)院;KH2PO4、Na2HPO4，AR，金維城鉬業(yè)股份有限公司化學(xué)分公司產(chǎn)品;硼酸，AR，上海國藥化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;聚乙烯吡咯烷酮，AR，上海國藥化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;酚酞指示劑，AR，天津市科密歐化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;H2O2，AR，上海昆化精細化工有限公司產(chǎn)品;HCl，AR，武漢華翔科潔生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，AR，上海國藥化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;研缽，ZH9167，北京中慧天誠科技有限公司;石英比色皿，石英微量，江蘇省宜興市精瑞光學(xué)元件廠;低溫離心機，TGL-16M，長沙湘儀離心機儀器有限公司;紫外分光光度計，UV2000，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器，78HW-1，杭州儀表電機有限公司;恒溫水浴鍋，TCKW-D-1，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑的配制

緩沖溶液:取10 mL Na2HPO4溶液與90 mL KH2PO4溶液，加入10-4mol/L EDTA-2Na 和去離子水，于25 ℃水浴攪拌下混合均勻，保持酸性pH=7～8，用去離子水補至100 mL，配制0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH=7～8);取1.24 g 硼酸，1.91 g 硼砂，加去離子水混合溶解，配制0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液配制(pH=8.8)。置于4 ℃儲存。

反應(yīng)溶液:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，抗壞血酸(ASA，現(xiàn)配現(xiàn)用)，H2O2;苯丙氨酸，HCl;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，還原型谷胱甘肽(GSSG)。

1.3 酶液的提取

取新鮮的鳶尾葉片洗凈，切成2 cm×2 cm 的塊片，用去離子水洗滌后用濾紙拭干，將塊片平鋪在濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于同一時間(單位:d)、168、210、252 μw/cm23 種不同的UV-B 輻射及同一輻射強度(單位:μw/cm2)、3 個不同時間段(根據(jù)不同酶處理要求，選擇第3、7、14、21 d 中任3 個時間取樣)下處理24 h，以誘導(dǎo)關(guān)鍵酶。將誘導(dǎo)處理的塊片加入液氮研成粉末，按樣本粉末質(zhì)量(g):緩沖液體積(mL)=1∶5～10 加入PVP 溶液中，于恒溫水浴攪拌反應(yīng)裝置下進行勻漿(注:溫度不超過25 ℃)，將所得勻漿抽氣過濾，濾液10 000 r/min，4 ℃下離心20 min，上清液為酶粗提取液。

1.4 活性的測定

1.4.1 APX 活性測定

取4 支10 mL 試管(3 支測定管A1、A2、A3，1 支對照管A0)，分別加入0.1 mL 酶液(168 μw/cm2)，1.7 mL 磷酸鹽緩沖液(pH=7)，0.1 mL 0.06 mol/L H2O2，0.1 mL 0.03×10-3mol/L ASA(對照管不加，用去離子水代替)。搖勻后置于20 ℃恒溫水浴鍋保溫30 min，利用紫外可見分光光度計在波長290 nm 下測定并記錄10、130 s 的吸光值A(chǔ)0、A1、A2、A3，其中ΔA空=A0-A1，ΔA測=A2-A3。同理，按照相同方法測定同一輻射時間、不同輻射強度與同一輻射強度、不同輻射時間的吸光度值，根據(jù)APX樣本質(zhì)量計算出APX 的活性，即:

式(1)中:HAPX為APX 的活性(U/g);V總為反應(yīng)體系總體積(mL);V液為酶液體積(mL);n稀為樣品測試前稀釋倍數(shù);ω 為消光摩爾系數(shù);r比色為比色半徑(cm);V取樣為取樣量(mL);m 為樣本鮮重(g);t 為反應(yīng)時間(min)。

1.4.2 PAL 活性測定

取4 支10 mL 試管(3 支測定管，1 支對照管)，分別加入1.0 mL 酶液(168 μw/cm2)，2.0 mL 硼酸鹽緩沖液(pH=8.8)，1.0 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸(對照管不加，用去離子水代替)，總體積4.0 mL。搖勻后置于30 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h，加入0.2 mL 6mol/L HCl 終止反應(yīng)，將沉淀離心，用對照管調(diào)零，在290 nm 處檢測測定管與對照管反應(yīng)液的吸光度，分別記為A測、A對，即ΔA=A測-A對，同理按照相同方法測定同一輻射時間、不同輻射強度與同一輻射強度、不同輻射時間的吸光度值，根據(jù)PAL 樣本鮮重計算PAL 的活性:

式(2)中:HPAL為PAL 的活性(U/g);ΔA=A測-A對;V總為反應(yīng)體系總體積(mL);V液為酶液體積(mL);V取樣為取樣量(mL);m 為樣本鮮重(g);t為反應(yīng)時間(min)。

1.4.3 GR 活性測定

取4 支10 mL 試管(3 支測定管，1 支對照管)，分別加入0.2 mL 酶液(168 μw/cm2)，3 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5，含10-3mol/LEDTA)，0.03 mL 3×10-3mol/L 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，0.1 mL 5×10-3mol/L 還原型谷胱甘肽(GSSG)(對照管不加，用去離子水代替，搖勻迅速倒入石英比色皿中，用對照管調(diào)零，紫外分光光度計在340 nm 處比色，30 s 時讀取吸光度值A(chǔ)1;將此比色皿中的比色液倒入原試管中，置37 ℃水浴2 min 后迅速倒入石英比色皿中，210 s時讀取吸光度值A(chǔ)2;求出2 次吸光度值差值ΔA=A1-A2。利用直接測定法測定蛋白質(zhì)濃度:①在紫外分光光度計上將未知蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以生理鹽水為對照，測得280、260 nm 波長的吸光度(A280及A260);②為方便起見，對于混合蛋白質(zhì)溶液，可用A280乘以0.75 代替其中蛋白質(zhì)的大致含量(104mg/L)。按照相同方法測定同一輻射時間、不同輻射強度與同一輻射強度、不同輻射時間的吸光度值，根據(jù)樣本蛋白濃度計算出GR 的活性。

式(3)中:HGR為GR 的活性(U/g);ΔA=A1-A2;n稀為樣品測試前稀釋倍數(shù);r比色為比色半徑(cm);m 為樣本鮮重(g);t 為反應(yīng)時間(min);C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/L)，C=1.45A280-0.74A260。

2 結(jié)果與分析

2.1 APX 結(jié)果分析

根據(jù)APX 酶活性計算公式對測定結(jié)果處理后，將計算結(jié)果通過Excel 繪制以酶含量(單位:μw/min)為縱坐標，輻射強度(單位:μw/cm2)為橫坐標的APX 含量變化圖1(a)與輻射時間(單位:d)為橫坐標的APX 含量變化圖1(b)。

圖1 APX 含量變化曲線

由圖1(a)可知，當(dāng)輻射時間相同時，APX 活性隨著輻射強度而增加，對照葉片的APX 活性在第7 d 取樣上升，第14 d 取樣APX 含量隨輻射強度的增強逐漸下降，第21 d 取樣中APX 含量呈現(xiàn)先降低再升高，與對照相比(酶含量持平約為1.18 μw/min)，C 時含量為零，說明低輻射對APX 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用。隨UV-B 輻射增加，APX 含量在H 時超過對照，第14、21 d 時，增加UV-B 輻射處理的酶活性均低于對照，活性約0.09 μw/min。圖1(b)中，當(dāng)輻射強度相同時，隨著輻射時間的增長，APX 活性先略微降低后持平，與對照相比(APX 含量為0.8～1 μw/min)延長輻射時間處理逐漸降低，輻射強度為C 和L 時，APX 含量先升高再下降趨勢，第7 d 取樣C 處理時，APX 含量為零，可能原因是輻射強度與輻射時間對酶活性產(chǎn)生了脅迫作用。輻射強度到達H 時，APX 含量先下降，然后保持平穩(wěn)，APX 含量基本保持在0.1 μw/min。

2.2 PAL 結(jié)果分析

根據(jù)PAL 酶活性計算公式對測定結(jié)果處理后，將計算結(jié)果通過Excel 繪制以酶含量(單位:μw/min)為縱坐標，輻射強度(單位:μw/cm2)為橫坐標的PAL 含量變化圖2(a)與輻射時間(單位:d)為橫坐標的PAL 含量變化圖2(b)。

圖2 PAL 含量變化曲線

由圖2(a)可知:同一輻射時間，PAL 含量隨著輻射強度呈現(xiàn)上升或先升高后降低的趨勢，前期積累PAL，中后期含量下降，后期趨于平衡。第7 d PAL 含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，而第3、21 d取樣PAL 含量一直上升，與對照相比(PAL 含量為0.04～0.05 μw/min)，UV-B 輻射處理有明顯差異(P＜0.05)，證明UV-B 輻射對酶活性有顯著影響;而圖2(b)中，當(dāng)輻射強度相同時，隨著輻射時間的延長，UV-B 輻射強度為C 時，酶含量先下降再升高，而UV-B 輻射強度為L 和H 時，酶含量均升高，在7 d 取樣時，PAL 酶含量較高且輻射強度為H 時的酶含量高于UV-B 輻射強度C 和L 時的酶含量，第21 d 時，輻射強度為L 時的PAL 含量大于輻射強度為C 和H 的PAL 含量，與對照相比(PAL 含量約為0.007 μw/min)略微上升，最高可達0.12 μw/min。

2.3 GR 結(jié)果分析

根據(jù)GR 酶活性計算公式對測定結(jié)果處理后，將計算結(jié)果通過Excel 繪制以酶含量(單位:μw/min)為縱坐標，輻射強度(單位:μw/cm2)為橫坐標的GR 含量變化圖3(a)與輻射時間(單位:d)為橫坐標的GR 含量變化圖3(b)。

圖3 GR 含量變化曲線

由圖3(a)可知，輻射時間一定，GR 含量隨著UV-B 輻射強度增強有較大的變化，第3、21 d 取樣中，GR 含量呈現(xiàn)大幅度降低的趨勢，輻射強度為L 時，第3 d 取樣中，GR 含量出現(xiàn)負值，可能是短時間的輻射時間對GR 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用，第7 d 取樣中，GR 含量逐漸下降，與對照相比(GR 含量為0.02～0.04 μw/min)，3 個不同時間段取樣時，低輻射強度對GR 活性較為有利;圖3(b)中，當(dāng)輻射強度相同，輻射時間逐漸延長時，3 種輻射強度下的GR 含量隨著取樣時間變化的幅度較大，低輻射時，3 個時間段的GR 含量較高，但趨于急速下降形勢，UV-B 輻射強度為C 時，第7 d 取樣中GR 的含量相對較好，UV-B 輻射強度為L 時，GR 活性表現(xiàn)為第7 d 取樣＞對照組＞第21 d 取樣＞第3 d 取樣，輻射強度L 處，第3 d 取樣分析時，GR 含量為零，可能是ASA 被還原，存在高輻射短時間等，造成GR 酶活性受到了脅迫，導(dǎo)致酶失活。第21 d 取樣時，3 種不同UV-B 輻射強度處理下，GR 含量在0.01～0.3 μw/min 范圍，與對照組(GR 含量約為0.02 μw/min)有顯著差異(P＜0.01)，第3、21 d 取樣中，GR 活性均大于第7 d，高輻射強度對GR 活性有脅迫作用。

3 結(jié)論

1)鳶尾葉中酶的活性與其逆境條件(輻射強度)和脅迫時間(輻射時間)有關(guān)。從酶活性的變化過程可以看出，低UV-B 輻射強度時，APX、PAX酶活性受到抑制，隨著時間的延長，植物形成相應(yīng)的防御機制，酶活性出現(xiàn)升高趨勢，而低UV-B 輻射強度時，GR 酶活性較好，這與自身攜帶的苯丙氨酸衍生物關(guān)系密切。

2)在輻射時間不變、輻射強度變化時，不同輻射強度梯度下，在輻射強度為C(168 μw/cm2)時，鳶尾葉GR 酶的活性最好，而APX、PAL 酶在輻射強度為H(252 μw/cm2)時活性相對較好。由此發(fā)現(xiàn)鳶尾植物中不同的酶抗輻射能力不同，其中APX、PAL 酶的抗輻射能力處在較高水平，能夠接受較強的輻射;而GR 酶的抗輻射能力最弱，不能夠承受高強度的輻射脅迫。

3)在輻射強度不變、輻射時間變化時，不同輻射時間梯度下，APX 酶在第14 d 取樣時，酶含量最高，活性最好，而GR、PAL 酶在第7 d 取樣時，酶含量相對較高，活性相對較好。由此發(fā)現(xiàn)鳶尾葉中關(guān)鍵酶活性和輻射時間的關(guān)系為在中等輻射時間段酶的活性較好，生長發(fā)育過程中等階段的輻射有利于生長，而短時間或長時間的輻射下，酶的含量較低，不適于鳶尾的生長發(fā)育。

4)對試驗測定結(jié)果整理分析發(fā)現(xiàn)，APX 含量在輻射強度為C(168 μw/cm2)與輻射為L(210 μw/cm2)時為零;GR 含量在輻射時間第3 d 時為零，說明過低的輻射強度對APX 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用，導(dǎo)致酶失活;同理，短時間的輻射時間對GR 酶活性產(chǎn)生了脅迫作用，導(dǎo)致植物中的酶在相應(yīng)階段失活。

5)鳶尾植物中不同酶對輻射強度的響應(yīng)機制不同，在不同的處理時間段，活性會產(chǎn)生不同的變化，與其體內(nèi)保護酶系統(tǒng)的活力及抗氧化物質(zhì)含量等有關(guān)。