構(gòu)巢曲霉幾丁質(zhì)酶ChiB 的結(jié)構(gòu)分析與重組表達(dá)

趙 靜，郭小利，金盛宇，王 宇，劉中華

(南京師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210000)

0 引言

真菌細(xì)胞壁是真菌特有的細(xì)胞器，主要由幾丁質(zhì)、葡聚糖和蛋白質(zhì)等組分組成［1-2］。近年來(lái)，侵襲性真菌感染已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的生命健康，通過(guò)抑制或干擾真菌細(xì)胞壁的合成過(guò)程能夠有效地抑制真菌的感染，因此以真菌細(xì)胞壁組分或以細(xì)胞壁合成相關(guān)酶為靶點(diǎn)的抗真菌藥物也逐漸成為研究熱點(diǎn)［3］。在真菌細(xì)胞壁合成的過(guò)程中，剛性的細(xì)胞壁在細(xì)胞壁重構(gòu)酶的作用下獲得可塑性，并在細(xì)胞膨壓的作用下擴(kuò)張［4］。本課題組圍繞真菌細(xì)胞壁的擴(kuò)張機(jī)制開(kāi)展研究。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，在模式擔(dān)子菌灰蓋鬼傘中，幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶參與細(xì)胞壁的重構(gòu)［5-6］。其中，幾丁質(zhì)酶CcChiE1 通過(guò)水解細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)參與灰蓋鬼傘子實(shí)體菌柄伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)胞壁擴(kuò)張，在子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中起重要作用［5］。

構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)是絲狀模式真菌，也是一種重要的人類條件致病真菌［7-8］。在構(gòu)巢曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶是否參與細(xì)胞壁重構(gòu)尚不清楚。本研究分析構(gòu)巢曲霉中與細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白CcChiE1 同源的幾丁質(zhì)酶，利用生物信息工具分析其結(jié)構(gòu)信息，檢測(cè)其在構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)量變化規(guī)律，利用大腸桿菌(Escherichia coli)重組表達(dá)系統(tǒng)并純化該蛋白，初步分析其酶學(xué)性質(zhì)，以探究其是否有可能通過(guò)水解幾丁質(zhì)參與構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)胞壁重構(gòu)，希望能以曲霉細(xì)胞壁重構(gòu)酶為靶點(diǎn)，為抗真菌藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株的構(gòu)建

A.nidulans FGSC A4 菌株用YMM 培養(yǎng)基(酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，尿苷1.2 g，尿嘧啶1.1 g，Ribo 1 mL，Trace element 1 mL，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g，115 ℃滅菌20 min)培養(yǎng)。E.coli DH5α 或Rosetta 菌株使用LB 培養(yǎng)基(酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂15 g，115 ℃滅菌20 min，待其冷卻至50 ℃左右時(shí)視需要加入Kanamycin 50 mg/L 或Chloromycetin 34 mg/L)。質(zhì)粒pET28a(+)購(gòu)自Novagen。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在Aspergillus Genome Database 中查找到A.nidulans 中幾丁質(zhì)酶的蛋白序列，從National Center for Biotechnology Information 查找得到灰蓋鬼傘幾丁質(zhì)酶ChiE1、ChiIII 的蛋白質(zhì)序列，利用MEGA5 軟件通過(guò)鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。構(gòu)巢曲霉幾丁質(zhì)酶的蛋白序列編號(hào)分別為:AN11059、AN11063、AN5454、AN0299、AN0509、AnChiB(AN4871)、An-ChiC(AN9390)、AN0221［9-13］，灰蓋鬼傘幾丁質(zhì)酶蛋白序列登錄號(hào)分別為:CcChiE1(XP_001841026.2)、CcChiIII(XP_001828436.2)。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

使用NCBI Conserved domain search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)A.nidulans 幾丁質(zhì)酶ChiB 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析［14］，SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對(duì)AnChiB 的信號(hào)肽序列進(jìn)行預(yù)測(cè)［15］，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測(cè)，三維模型結(jié)構(gòu)通過(guò)I-TASSER 分析預(yù)測(cè)，選取得分較高的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步通過(guò)TM-alia 進(jìn)行準(zhǔn)確地分析和鑒定。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

將A.nidulans 的孢子接種于YMM 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，收取培養(yǎng)的菌絲使用液氮進(jìn)行快速冷凍，用柱式真菌總RNA 快速抽提純化試劑盒(上海，生工)提取總RNA，用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京，諾唯贊)去除總RNA 的DNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix(High ROX Premixed)定量試劑盒(南京，諾唯贊)對(duì)cDNA 進(jìn)行定量擴(kuò)增。以 A.nidulans 的 actin(AN6542)作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCT法獲得An-ChiB 在曲霉不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。

定量PCR 引物為:Q-actin-F:GTATGTGCAAGGCCGGTTTC;Q-actin-R:TCATCACCGACGTAGGAG TCC。Q-ChiB-F:CAGGCCAGAGACTGGCGAAG;QChiB-R:CAAGCCCAGCTGCTTGACG。

1.5 基因的克隆與重組表達(dá)

以A.nidulans FGSC A4 的幾丁質(zhì)酶ChiB(Gen-Bank 編號(hào)AN4871)的cDNA 序列為模板，委托南京思普金生物公司參照E.coli 的密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化和全基因合成。將該序列連接到pET28a(+)的NdeI 和HindIII 酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-AnChiB。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，利用引物AnChiBF/R(AnChiB-F:GCGCGGCAGCCATATGATGAGTGGTTATAAGACCGTTGGTT;AnChiB-R:AGTGCGGCCGCAAGCTT TTAGCTGCTCGGAAAGCCG)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。挑選陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，并用SanPrep 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海，生工)抽提質(zhì)粒送往南京生工生物公司對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與AnChiB 的cDNA 序列進(jìn)行比對(duì)。將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET28a(+)-AnChiB 導(dǎo)入原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌株pET28a(+)-AnChiB/E.coli Rosetta。

重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)采用乳糖操縱子誘導(dǎo)表達(dá)模型，將重組菌株pET28a(+)-AnChiB/E.coli Rosetta 接種至5 mL LB (Kana/Chl)液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm 搖床中培養(yǎng)12 h 后，取1 mL 菌液接種至100 mL LB (Kana/Chl)液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液的OD600培養(yǎng)至0.8～1.2 時(shí)，向菌液中加入終濃度為0.1 mM 的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h 以完成誘導(dǎo)。

離心收集誘導(dǎo)后的菌體用50 mM pH 6.0 的Bis-Tris 緩沖液重懸至20 mL，參照ProteinIsoTM Ni-NTA Resin(北京，TransGen Biotech 公司)的說(shuō)明書(shū)破碎菌體，并利用鎳離子親和層析柱對(duì)重組的AnChiB 蛋白進(jìn)行分離純化。收集純化后的酶液，與蛋白上樣緩沖液混合后于100 ℃下加熱10～15 min，待冷卻后進(jìn)行充分混勻并上樣至12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳［16］。

1.6 水解酶活性測(cè)定

以幾丁質(zhì)粉末(chitin powder)，膠態(tài)幾丁質(zhì)(colloidal chitin)，85% 殼聚糖(85% deacetylated chitosan)，75%殼聚糖(75% deacetylated chitosan)以及乙二醇幾丁質(zhì)(glycol chitin)、乙二醇?xì)ぞ厶?glycol chitosan)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物，檢測(cè)重組表達(dá)酶AnChiB 對(duì)不同底物的水解酶活性。200 μL 反應(yīng)體系中含有0.5%的底物、50 mM pH 5.0 的醋酸鈉緩沖液和適量的酶液。反應(yīng)體系充分混合后37 ℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后用DNS 法檢酶活性［17］。1 個(gè)酶活單位(U)定義為:在一定反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1.0 μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量。

測(cè)定不同pH 對(duì)AnChiB 酶活性影響時(shí)，反應(yīng)體系中加入不同pH 的緩沖液進(jìn)行測(cè)定，將酶活最大時(shí)的pH 條件下的酶活記為100%，計(jì)算不同pH條件下的相對(duì)酶活并以百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 AnChiB 的同源性與蛋白結(jié)構(gòu)分析

本課題組前期的研究成果顯示，灰蓋鬼傘的幾丁質(zhì)酶ChiE1 和ChiIII 誘導(dǎo)真菌細(xì)胞壁擴(kuò)張，ChiE1 在子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用［5］。利用MEGA 軟件，用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析構(gòu)巢曲霉中的8 個(gè)幾丁質(zhì)酶與灰蓋鬼傘幾丁質(zhì)酶ChiE1、ChiIII 的蛋白質(zhì)序列的同源關(guān)系。An-ChiB 的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，AnChiB、AN5454 與灰蓋鬼傘ChiE1 處于同一分枝，An-ChiB、AN5454 與CcChiE1 親緣關(guān)系較近，見(jiàn)圖1(a)。蛋白序列比對(duì)分析顯示，AnChiB 與CcChiE1的同源性為43.37%(Max Score=400)，AN5454與CcChiE1 的同源性為38.22% (Max Score=363)。選擇 AnChiB 做進(jìn)一步分析和研究，AN5454 的研究將另外開(kāi)展。

AnChiB(AN4871)的蛋白質(zhì)序列由446 個(gè)氨基酸殘基組成。使用NCBI Conserved domain search 分析顯示，AnChiB 含有一個(gè)糖基水解酶家族18 幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基55—395，GH18_chitinase domain，cd06548)，表明其屬于GH18_chitinase 二型(type II)幾丁質(zhì)水解酶［18］。使用SignalP 4.1 Server 分析顯示，AnChiB 的N 端第1—18 氨基酸殘基為信號(hào)肽。由PSIPRED 預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)后顯示，AnChiB 的信號(hào)肽由α螺旋和少部分的無(wú)規(guī)則卷曲組成，在整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)中，α 螺旋占31.83%(粉色)，β 折疊占15.02%(黃色)，無(wú)規(guī)則卷曲占53.14%，見(jiàn)圖1(b)。利用I-TASSER 預(yù)測(cè)AnChiB 的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明An-ChiB 的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)為由8 個(gè)α-螺旋(α-helice)(藍(lán)色)和8 個(gè)β-折疊(β-strand)(紅色)組成的(β/α)8TIM 桶狀結(jié)構(gòu)，催化位點(diǎn)D164、D166和E168 位于第4 個(gè)β-折疊上;在第7 個(gè)α-螺旋和β-折疊間存在一個(gè)插入序列(黃色)，與桶狀結(jié)構(gòu)形成一條狹長(zhǎng)的底物結(jié)合溝，底物結(jié)合位點(diǎn)(W43，W83，W95，W128，W238，W372，F(xiàn)260)延底物結(jié)合溝分布(C-score=0.23)，見(jiàn)圖1(c)和圖1(d)。

圖1 AnChiB 的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2 AnChiB 的SDS-PAGE 鑒定及酶活測(cè)定

按照前述方法構(gòu)建得到重組表達(dá)菌株pET28a(+)-AnChiB/E.coli Rosetta，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證克隆重組的AnChiB 基因與NCBI 中報(bào)道的該基因的cDNA序列完全一致。SDS-PAGE 分析顯示，與空載對(duì)照菌株相比，誘導(dǎo)表達(dá)后重組表達(dá)菌株的上清中增加了一條大小約為45 kDa 的蛋白條帶。利用鎳離子親和層析柱對(duì)粗酶液進(jìn)行分離純化后，得到一條大小約為45 kDa 的蛋白條帶。純化后的蛋白濃度為0.88 mg/mL，見(jiàn)圖2(a)。圖2(a)中:M 表示蛋白Marker;1 代表空載對(duì)照上清;2 代表AnChiB重組表達(dá)上清;3 代表純化的酶。

分析AnChiB 對(duì)不同底物的水解酶活性，其結(jié)果顯示，AnChiB 可以水解晶體幾丁質(zhì)、膠態(tài)幾丁質(zhì)、乙二醇幾丁質(zhì)和85%脫乙?；瘹ぞ厶?，不能水解75%脫乙?；瘹ぞ厶恰⒁叶?xì)ぞ厶呛汪燃谆w維素，同時(shí)AnChiB 的最適底物是膠態(tài)幾丁質(zhì)(表1)。分析AnChiB 的最適pH 值，結(jié)果顯示在pH 值為5.0 時(shí)，AnChiB 的水解酶活性達(dá)到最高，偏酸或偏堿都會(huì)導(dǎo)致酶活下降，在pH 值為8.0～9.0 的條件下，水解酶活性將會(huì)降低至最大酶活的40%以下，見(jiàn)圖2(b)。

表1 幾丁質(zhì)酶AnChiB 的底物特異性情況

圖2 AnChiB 的重組表達(dá)純化及最適pH 分析結(jié)果

2.3 AnChiB 在構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)不同階段的表達(dá)量水平

為了分析AnChiB 在構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)不同階段的表達(dá)量情況，分別收集了培養(yǎng)0、6、12、24、48、72和96 h 的菌體，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)AnChiB 在不同樣本中的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)6 h 后，AnChiB的表達(dá)量明顯上升，是0 h 時(shí)表達(dá)量的4.20 倍，見(jiàn)圖3。在第12、24 h，AnChiB 的表達(dá)量分別為0 h的2.44 倍和5.56 倍，與6 h 相比無(wú)顯著差異(圖3)。在第48 h，AnChiB 的表達(dá)量顯著增加，與0 h相比上升34.91 倍，與6 h 相比上升7.54 倍，并達(dá)到最高值(圖3)。AnChiB 的表達(dá)量在72 h和96 h下降，降低到0 h 的3.58 和2.90 倍(圖3)。圖3中，＊＊＊表示差異極顯著(p＜0.001)。

圖3 AnChiB 在構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)不同階段的相對(duì)表達(dá)量水平

3 討論

本課題組在前期研究中以擔(dān)子菌模式生物灰蓋鬼傘為研究對(duì)象，揭示了幾丁質(zhì)酶在真菌細(xì)胞壁擴(kuò)張過(guò)程中起重要作用［5-6］。但在子囊菌中哪個(gè)幾丁質(zhì)酶參與細(xì)胞壁擴(kuò)張尚不清楚。故而，本研究以絲狀真菌模式生物構(gòu)巢曲霉為研究對(duì)象，通過(guò)序列同源性分析和比對(duì)，確定在構(gòu)巢曲霉中幾丁質(zhì)酶ChiB 與灰蓋鬼傘細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白幾丁質(zhì)酶ChiE1 的同源度最高。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析顯示，AnChiB 與CcChiE1 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有較高的相似性:首先，2 個(gè)幾丁質(zhì)酶都具有N 端信號(hào)肽，定位在胞外空間;第二，2 個(gè)幾丁質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)高度相似，都具有一個(gè)狹長(zhǎng)的底物結(jié)合溝。由于具有相似的結(jié)構(gòu)，AnChiB 與灰蓋鬼傘細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白幾丁質(zhì)酶ChiE1 也具有相似的酶學(xué)性質(zhì):①2個(gè)幾丁質(zhì)酶都具有水解晶體幾丁質(zhì)的活性，前期研究表明，具有水解晶體幾丁質(zhì)活性的幾丁質(zhì)酶往往具有誘導(dǎo)細(xì)胞壁擴(kuò)張的能力;②2 個(gè)幾丁質(zhì)酶的最適pH 值均為5.0，這與真菌生長(zhǎng)發(fā)育的最適pH 值一致［19］。有文獻(xiàn)報(bào)道，AnChiB 在構(gòu)巢曲霉的衰亡期高表達(dá)并參與菌絲的自溶［12］。本研究的結(jié)果表明:AnChiB 在構(gòu)巢曲霉的衰亡期(48 h)達(dá)到最高;但在構(gòu)巢曲霉菌絲生長(zhǎng)初期(6 h)，AnChiB 的表達(dá)量即明顯上升。AnChiB 可能參與構(gòu)巢曲霉的菌絲生長(zhǎng)，并參與細(xì)胞壁的擴(kuò)張。但由于構(gòu)巢曲霉的菌絲生長(zhǎng)為頂端生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)區(qū)域非常微小，需要的細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白較微量，所以，AnChiB 在菌絲生長(zhǎng)初期的表達(dá)量雖然顯著上升，但上升幅度不大［20-21］。

4 結(jié)論

構(gòu)巢曲霉AnChiB 具有真菌細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白的特征:①定位在胞外空間;②具有典型的底物結(jié)合溝;③具有水解晶體幾丁質(zhì)的活性等。本研究提示:AnChiB 不僅參與構(gòu)巢曲霉菌絲的自溶，還可能參與菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)胞壁擴(kuò)張。為進(jìn)一步研究AnChiB 的生理功能，以及絲狀真菌的細(xì)胞壁擴(kuò)張機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持，希望能為以曲霉細(xì)胞壁重構(gòu)酶為靶點(diǎn)的抗真菌藥物的研發(fā)提供新的思路。