乳酸菌食品中污染菌的計數(shù)和MALDI-TOF MS鑒定

凌莉，呂敬章，陳晶，江月，萬志剛，劉婧文，嚴瓊英，盧行安

1(廣州海關技術中心，廣東 廣州，510623)2(深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳，518045) 3(深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳，518045)4(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東 深圳，518131) 5(廣東藥科大學，廣東 中山，528045)6(中國檢驗檢疫科學研究院，北京，100176)

乳酸菌是一類利用可發(fā)酵的碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌，從分類學上看，乳酸菌至少包含了乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、芽胞桿菌屬等23個菌屬[1]。有關乳酸菌提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率、預防和治療疾病、調(diào)節(jié)機體的免疫力等益生功能已有很多報道[2]，最新的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌還可通過“腦腸軸”對行為模式進行調(diào)節(jié)[3]。除了用于生產(chǎn)發(fā)酵乳，為改善產(chǎn)品風味等原因，乳酸菌也廣泛添加在飲料、奶粉、餅干、糖果等食品中[4-9]。

在食品安全國家標準中，對乳酸菌食品質(zhì)量安全的關注點，主要集中在兩方面：一是乳酸菌的含量。由于乳酸菌必須達到一定的數(shù)量才能發(fā)揮益生作用，因此在GB 19302—2010《食品安全國家標準 發(fā)酵乳》、GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》和GB 7101—2015《食品安全國家標準 飲料》中均規(guī)定，乳酸菌的含量不得小于106CFU/mL(g)。二是乳酸菌食品的污染菌，包括菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌酵母等指示菌，以及沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌。在含乳酸菌食品的國家標準中，對菌落總數(shù)的規(guī)定存在較大差異。因為產(chǎn)品中存在活的乳酸菌，進行菌落總數(shù)測定時，一些乳酸菌會在平板計數(shù)瓊脂上生長，而對菌落總數(shù)結果造成干擾，發(fā)酵乳和飲料的食品安全國家標準因此沒有設置菌落總數(shù)的限量。然而，有些標準如GB 10765—2010，基于菌落總數(shù)測定是在有氧條件下進行的，對添加了厭氧乳酸菌的產(chǎn)品，又規(guī)定了菌落總數(shù)的限量。這些標準的差異，對乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌的計數(shù)造成了較大的困擾。一方面，食品安全國家標準對食品中添加的菌株是否為厭氧菌的判斷，沒有具體規(guī)定；另一方面，為保持雙歧桿菌等厭氧菌的高活性并發(fā)揮益生功效，一些菌劑的生產(chǎn)廠商對雙歧桿菌進行了耐氧馴化[10]，使得一些傳統(tǒng)上認為是厭氧的乳酸菌，在有氧的條件下也能生長。因此，須從計數(shù)平板上排除乳酸菌的干擾，只是特異性針對非乳酸菌等污染菌進行計數(shù)。

對計數(shù)瓊脂上菌落的鑒定，以迅速準確區(qū)分乳酸菌與非乳酸菌，是乳酸菌食品中污染菌計數(shù)的又一難點。采用傳統(tǒng)的生物化學方法鑒定乳酸菌，操作繁瑣且準確性低[11]；近來興起的一些分子生物學方法檢測乳酸菌，如PCR法、16S rDNA/rRNA基因序列分析法、變性梯度凝膠電泳法等等，但都要采用特定的引物或探針，針對特定菌進行檢測，并不適合對未知菌的鑒定[12-15]，變性梯度凝膠電泳法等方法還要對PCR產(chǎn)物進行后處理[16]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜是近年來發(fā)展起來的一種用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子鑒定的新技術，其原理是將待測菌與基質(zhì)混合后，用激光轟擊電離，根據(jù)到達檢測器的時間及離子的數(shù)量，繪制橫軸為質(zhì)荷比m/z、縱軸為峰強度值的圖譜，與數(shù)據(jù)庫中的圖譜進行比對后對微生物進行鑒定[17]，整個操作過程只需1 h便有檢測結果。該方法具有操作簡單、速度快、成本低、通量高的特點，而且鑒定前無需進行革蘭氏染色，還可用于芽胞菌、霉菌、酵母的快速鑒定，特別適用于未知菌的鑒定。

因此，本文參考ISO 13559:2002—Butter, fermented milks and fresh cheese—Enumeration of contaminating microorganisms-Colony-count technique at 30 ℃，使用不含糖的計數(shù)瓊脂 (count agar sugar free，CASF)，對含活乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌進行計數(shù)；同時按照食品安全國家標準GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》的方法，分別對乳酸菌食品中的乳酸菌、菌落總數(shù)進行計數(shù)。并采用MALDI-TOF MS法對CASF和平板計數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)平板上的菌落進行鑒定，以迅速區(qū)分乳酸菌與非乳酸菌，探討適合乳酸菌食品中污染菌的計數(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

INE800型恒溫培養(yǎng)箱，德國MEMMERT公司；MARK Ⅱ厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)，荷蘭ANOXOMAT公司；VITEK MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜，法國生物梅里埃公司。

MRS瓊脂(批號190124)、PCA(批號201203)，北京陸橋技術股份有限公司；CASF(批號VM913678011)，MERCK公司；CHCA基質(zhì)液(批號1008255570)，法國生物梅里埃公司；大腸埃希氏菌ATCC 8739，Microbiologics。

動物雙歧桿菌Bb-12菌粉、乳雙歧桿菌菌粉、保加利亞乳桿菌菌粉、德氏乳桿菌菌粉、嗜熱鏈球菌菌粉、長雙歧桿菌菌粉，呼和浩特市某乳酸菌粉廠；國產(chǎn)和進口含活乳酸菌的固體飲料10份、發(fā)酵乳2份，市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌、非乳酸菌、菌落總數(shù)計數(shù)

無菌取25 g樣品置于裝有225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)2 min，選取2～3個合適的稀釋度，每個稀釋度各吸取0.1 mL樣品勻液涂布于CASF瓊脂表面，30 ℃需氧培養(yǎng)72 h；同時吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿中，傾注MRS瓊脂培養(yǎng)基， 36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h；另外吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿中，傾注PCA培養(yǎng)基，36 ℃需氧培養(yǎng)48 h。每個稀釋度做2個平行，15 min內(nèi)完成從樣品稀釋到平皿傾注。每個樣品重復3次實驗。

1.2.2 菌落鑒定

將待鑒定菌落劃線于血平板36 ℃培養(yǎng)24 h，或接種在MRS平板后36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，挑取培養(yǎng)物的單個菌落涂布至靶板孔，立即加入1 μL CHCA基質(zhì)液；同時挑取質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC 8739純培養(yǎng)物涂布至質(zhì)控孔，立即加入 1 μL CHCA基質(zhì)液；干燥后，用VITEK MS進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌粉的計數(shù)結果及分析

由表1數(shù)據(jù)可見，6種乳酸菌菌粉在MRS平板上生長良好，乳酸菌計數(shù)結果與其標稱的數(shù)量一致。在有氧條件下培養(yǎng)的PCA和CASF平板上，未見菌落生長，表明這6種乳酸菌在PCA瓊脂上不生長，菌粉也沒有受到非乳酸菌的污染。

表1 乳酸菌粉的計數(shù)結果 單位：CFU/g

2.2 市售含乳酸菌食品的計數(shù)和鑒定結果及分析

從表2可知，市售的10種固體飲料和2種發(fā)酵乳的乳酸菌計數(shù)結果均大于106CFU/g，表明這些食品中乳酸菌含量符合相關標準GB 7101—2015和GB 19302—2010的要求。而這些乳酸菌食品的PCA和CASF的計數(shù)和菌落鑒定結果大致有以下5種情況。

表2 市售乳酸菌食品的計數(shù)及鑒定結果 單位：CFU/g

(1)PCA上既有較多細小的菌落，又有少量較大的菌落(圖1-a)，CASF上少量的菌落都比較大(圖1-b)，如樣品1。PCA上細小的菌落，MALDI-TOF MS鑒定為凝結芽胞桿菌，是樣品標稱添加的乳酸菌。PCA和CASF上較大的菌落，鑒定為蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌，屬于污染菌。

a-PCA; b-CASF圖1 固體飲料GS在不同培養(yǎng)基上的菌落Fig.1 Colonies of solid beverage GS on different agar plates

(2)PCA和CASF少量的菌落都比較大，如樣品2。PCA和CASF上較大的菌落，鑒定為地衣芽胞桿菌和克勞氏芽胞桿菌，屬于污染菌。

(3)PCA上有較多細小的菌落，CASF上少量的菌落都比較大，如樣品3和樣品4。PCA上細小的菌落，MALDI-TOF MS鑒定為干酪乳桿菌(圖2)，是樣品標稱添加的乳酸菌。CASF上較大的菌落，鑒定為蠟樣芽胞桿菌(圖3)，屬于污染菌。樣品11的菌落鑒定結果也是如此。

圖2 干酪乳桿菌的MALDI-TOF MS圖譜Fig.2 Mass spectrum of L. casei

圖3 蠟樣芽胞桿菌的MALDI-TOF MS圖譜Fig.3 Mass spectrum of B. cereus

(4)PCA和CASF上均未見菌落生長，如樣品5～樣品8。

(5)PCA上有較多細小的菌落， CASF上未見的菌落生長，如樣品9、10、12。PCA上細小的菌落，MALDI-TOF MS鑒定結果屬于乳酸菌。

對以上乳酸菌食品的計數(shù)和鑒定結果的分析發(fā)現(xiàn)，由于某些乳酸菌可在PCA上形成細小的菌落，因此不宜用菌落總數(shù)測定來計數(shù)乳酸菌食品中的污染菌。然而CASF上的菌落，經(jīng)鑒定均不是樣品標稱添加的乳酸菌，而是蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌等污染菌，CASF可以用來計數(shù)乳酸菌食品中的污染菌。

3 結論與討論

由于乳酸菌的益生功能，乳酸菌現(xiàn)已被廣泛添加到許多食品中，含乳酸菌食品的質(zhì)量安全也受到廣泛關注[18-19]。乳酸菌食品中污染菌的數(shù)量，也是指示乳酸菌食品加工過程衛(wèi)生狀況的重要指標之一，但是乳酸菌食品中污染菌計數(shù)的難度較大，導致乳酸菌食品菌落總數(shù)限量的設置和結果判斷分歧較大。

乳酸菌食品中污染菌計數(shù)的難點之一，是缺乏特異性的計數(shù)瓊脂。近來有研究根據(jù)乳酸菌需要利用糖類以及適宜酸性生長環(huán)境的特性，采用pH為8.0且不含糖的計數(shù)瓊脂CASF，對乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌進行計數(shù)[20]。本文采用這一方法，對12種市售乳酸菌食品中污染菌計數(shù)發(fā)現(xiàn)，該瓊脂可排除樣品中乳酸菌的干擾，并特異性計數(shù)乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌。

本文采用PCA和CASF平板，對乳酸菌食品菌落總數(shù)的計數(shù)結果進行比對，并利用MALDI-TOF MS技術對未知菌的快速鑒定優(yōu)勢，對PCA和CASF平板上的菌落進行快速準確鑒定，達到迅速區(qū)分乳酸菌與非乳酸菌的目的。本文發(fā)現(xiàn)，采用CASF計數(shù)，結合MALDI-TOF MS鑒定技術，可迅速準確地對乳酸菌食品中污染菌進行計數(shù)和鑒定。