林曉敏，朱 健，湯思敏，麻淳雅，程鈺瑩，姚 璐，倪楚盛，王 平，王玉竹

（1.中南林業(yè)科技大學 環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.稻米品質安全控制湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410004）

鎘（Cd）是一種對人類與動植物具有極強毒性的重金屬元素[1]。由于工礦業(yè)的發(fā)展和農藥化肥的不合理使用，造成Cd 廢水日益增多，一旦含Cd廢水未達標處理直接排放到河流中，就會成為水生食物鏈的污染源。Cd 能在動植物體內富集，通過食物鏈傳遞進入人體，Cd 與體內蛋白質分子結合，進而破壞蛋白質分子的分子結構導致其失活，最終引起人體急性、慢性中毒，如Cd 會干擾人體對Ca、P 的吸收，造成維生素D 異常代謝，從而引起腎臟和骨頭的病變（痛痛?。┑萚2-3]。含Cd 廢水主要來源于尾礦排水、金屬礦山開采等，水質來源不同毒害程度也有很大的差異，其嚴重侵犯人類享受健康、清潔、安全生存空間的合法權益[4-6]。目前Cd 污染廢水的處理方法包括化學沉淀法、離子交換法、膜分離法、電解法和微生物吸附法[7-8]，在實際應用中，化學沉淀法存在試劑投放量大，易造成二次污染等問題；離子交換法、膜分離法、電解法均存在處理成本較高的局限。與之相比，微生物吸附法具有效率高、速度快、無二次污染等優(yōu)點[9-10]。微生物吸附法是利用生物體本身的化學結構和成分特性對溶液中的金屬離子進行吸附，吸附的過程主要是羥基、羧基、疏基等多種配位基團起作用，這些配位基團通過與金屬離子絡合來完成對金屬離子的吸附[11-12]。羅爾斯通氏菌最初被應用于苯代污染物的降解和PHB 的合成方面的研究[13]，而付瑾等[14-15]從銅礦土壤中篩選了一株皮氏羅爾斯通氏菌，發(fā)現(xiàn)了其具有極高的耐鎘性，并且初步探究了其富集鎘機理，擬合了飽和吸附量為16.7 mg/g。目前關于利用羅爾斯通氏菌株干菌體吸附去除Cd2+的研究已有報道，付瑾分離的皮氏羅爾斯通氏菌吸附能力較弱，不同種類的羅爾斯通氏菌存在各項差異。本研究從鎘污染土壤中篩選了一株吸附能力較強的耐鎘羅爾斯通氏菌，將其制成菌粉，研究了其對Cd2+的吸附能力以及吸附機制，以期為微生物吸附含鎘廢水提供功能菌株和奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

菌株源自湖南省長沙市北山試驗基地土壤（采樣深度0～20 cm），土壤基本性質：pH 值5.2，Cd 濃度1.6 mg/kg，土壤CEC 33.4 cmol/kg，OM值28.1 g/kg。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨（液體）培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g（固體培養(yǎng)基添加）。121℃，滅菌20 min 后使用。

1.1.3 菌懸液的制備

在無菌條件下，使用接種環(huán)從固體培養(yǎng)基中挑選純化好的菌株接種至液體培養(yǎng)基，120 r/min，30 ℃的條件下培養(yǎng)20 h，5 000 r/min 條件下離心15 min 后棄去上清液，無菌水洗滌菌體，離心，重復洗滌3 次，收集菌體制成菌懸液。于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 耐Cd 菌株的分離、純化

將10 g 土樣加入90 mL 無菌水中，設置搖床轉速150 r/min、溫度28℃，振蕩45 min 后靜置30 min 取上清液。采用稀釋涂布法分別取100 μL均勻涂布在Cd2+含量為50 mg/L 的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察其生長狀況，每個濃度設置3 個平行。將平板上形態(tài)各異的單菌落挑選出接種于Cd2+含量為100 mg/L 的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上并劃線，以100 mg/L 為增量逐次遞增培養(yǎng)基中Cd2+含量，以確定各菌株的耐受閾值。將分離出來的耐Cd 菌株進行多次劃線純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 菌粉的制備

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，按接種量1%接種后在30 ℃、120 r/min 下培養(yǎng)48 h。采用冷凍高速離心機離心收集菌體，滅菌鍋滅菌后60 ℃恒溫烘干，用研缽磨成粉末狀后用密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 耐Cd 菌株的鑒定

16S rDNA 序列分析：采用Ezup 柱式 細菌基因組DNA 抽提試劑盒（購自生工生物工程股份有限公司）提取優(yōu)選菌株的總基因組DNA，擴增優(yōu)選菌株的16S rDNA，設計引物 為：27F，AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R，GGTTACCTTGTACGACTT。PCR 反應體系為：0.5 μL Template，2.5 μL10×Buffer，1 μL dNTP，0.2 μL 酶，0.5 μL F，0.5 μL R，總反應體系為 25 μL?？偡磻w系為20 μL，PCR 條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)；72℃修復延伸10 min，4 ℃終止反應?；厥誔CR 擴增產物，交由生工生物工程公司完成測序，將測序結果在NCBI 上進行BLAST 分析，并利用MEGA 5.0 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌粉對Cd2+的吸附影響因素及規(guī)律

1）溫度對菌粉吸附Cd2+的影響

按照0.2 g/L 投加量向Cd2+濃度為100 mg/L 的溶液投加菌粉，調節(jié)體系初始pH 值為7.0，設置搖床轉速為120 r/min，分別于10、20、30、40、50 ℃下吸附3 h，離心收集上清液，測定Cd2+含量。

2）初始pH 值對菌粉吸附Cd2+的影響

按照0.2 g/L 投加量向Cd2+濃度為100 mg/L 的溶液投加菌粉，設置搖床環(huán)境30℃、120 r/min，調節(jié)初始pH 值分別為3.0、5.0、6.0、7.0、9.0，吸附3 h 后離心收集上清液，測定Cd2+含量。

3）時間對菌粉吸附Cd2+的影響

按照0.2 g/L 投加量向Cd2+濃度為100 mg/L的溶液投加菌粉，調節(jié)體系初始pH 值為7.0，設置搖床環(huán)境30 ℃、120 r/min，分別吸附30、60、90、120、180、240 min 后離心收集上清液，測定Cd2+含量。

4）初始濃度對菌粉吸附Cd2+的影響

按照0.2 g/L 投加量分別向Cd2+初始濃度為50、100、200、300、400 mg/L 的溶液投加菌粉，設置搖床環(huán)境30℃、120 r/min，調節(jié)初始pH 值分別 為7.0，吸附3 h 后離心收集上清液，測定Cd2+含量。

5）投加量對菌粉吸附Cd2+的影響

分別按照0.2、0.4、1、1.6、2 g/L 投加量向Cd2+濃度為100 mg/L 的溶液投加菌粉，調節(jié)體系初始pH 值為7.0，設置搖床環(huán)境30 ℃、120 r/min，吸附3 h 后離心收集上清液，測定Cd2+含量。

1.2.3 菌粉對Cd2+的吸附條件優(yōu)化

通過正交試驗優(yōu)化了菌粉對Cd2+吸附條件。選擇菌粉投加量（g/L）、吸附時間（h）、pH 值、溫度（℃）4 個因素，每個因素設計3 個水平進行正交試驗L9（34），試驗設計見表1。

表1 正交試驗各因素水平Table 1 Scope of the factors

1.2.4 菌粉對Cd2+等溫吸附屬性分析

配制Cd2+濃度分別為10、50、200、400、500、600、800 mg/L 的廢水，按0.2 g/L 投加量加入菌粉。吸附條件為：120 r/min、30 ℃、pH 值6.0。每個梯度設置3 組平行以及空白對照。搖床震蕩3 h 后離心收集上清液，用原子吸收測定Cd2+含量。采用Langmuir、Freundlich 等溫吸附模型對試驗數(shù)據(jù)進行擬合，分析LC 菌粉對Cd2+的吸附機制。

Langmuir 等溫線方程：

Freundlich 方程：

式中：qmax為飽和吸附量（mg/g）；qe為平衡吸附量（mg/g）；Ce為平衡質量濃度（mg/L）；KL為Langmuir 吸附特征常數(shù)；C0表示初始Cd2+質量濃度最大值（mg/L）；KF和n為Freundlich 吸附特征常數(shù)。

1.2.5 吸附前后菌粉表征分析

分別采用掃描電鏡（SEM）、能譜（EDX）、紅外光譜（FTIR）分析了吸附前后菌體微觀結構、元素構成、官能團組成的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

菌粉對Cd2+的吸收量（q）的計算公式分別為：

式中：C0為對照組上清液Cd2+質量濃度(mg/L)；Ct為試驗組上清液Cd2+質量濃度（mg/L）；V為溶液的體積（L）；M為菌粉投加量（g）。所有試驗處理設置3 個平行，取均值進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

分離純化后得到了一株耐鎘菌株，命名LC。通過平板劃線試驗最終確定了LC 菌株對Cd2+的耐受閾值為850 mg/L。經16S rDNA 測序后將測序結果通過NCBI（NCBI 登錄號為MK418966）進行BLAST 比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。LC 菌株與Ralstoniaspp.親緣關系最近，與Bacillus vietnamensispartial 關系較遠，結合形態(tài)觀察和序列分析初步鑒定LC 菌株為羅爾斯通氏菌Ralstoniaspp.。

2.2 菌粉對Cd2+吸附的影響因素及規(guī)律分析

2.2.1 溶液溫度的影響

圖1 LC 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 LC strain phylogenetic tree

溶液溫度對LC 菌粉吸附量的影響見圖2（a）。由圖2可知，隨著溫度的升高，菌粉對Cd2+的吸附量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在30 ℃時達到最大值（100.4 mg/g）。說明菌粉Cd2+的吸附量受溫度影響，溫度過低（10 ℃）和過高（50 ℃）都不利于吸附的進行。溫度過低，溶液自由擴散速度減慢，菌粉表面離子交換速率降低。在一定的范圍內，溫度的升高可以促進菌粉的吸附，溫度越高，其溶液中的離子擴散速度加快，菌粉表面吸附位點與Cd2+的接觸機會增多[16-17]。

2.2.2 溶液初始pH 值的影響

溶液初始pH 值對菌粉吸附Cd2+的影響見圖2（b），隨著pH 值的升高，吸附量呈現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律。LC 菌粉的吸附最佳點在pH 值6.0，吸附量為145.9 mg/g。初始pH 值是一個重要的吸附參數(shù)，對溶液有很大的影響，Cd2+的狀態(tài)會隨著pH 值的變化而改變。溶液呈酸性時，大量H+會和Cd2+競爭吸附劑表面的自由位點，使菌粉表面質子化，導致吸附降低；隨著pH 值的升高，H+占據(jù)的吸附位點被釋放出來，吸附量不斷上升；而在pH 值呈堿性時，Cd2+與OH-形成Cd(OH)2沉淀[18-19]，溶液中可吸附的Cd2+減少，吸附量下降。

2.2.3 吸附時間的影響

時間對菌粉吸附的影響見圖2（c）。隨著吸附時間的延長，菌粉對Cd2+的吸附量呈逐漸上升的趨勢，當吸附時間為180 min 時，吸附量達到110.7 mg/g，而后有所下降。菌粉的生物吸附一般很快，但具體時間受環(huán)境變化的影響，最初由于溶液的混合作用，一部分Cd2+迅速占據(jù)菌粉表面吸附位點，之后依靠水溶液的傳輸作用，幫助菌粉吸附Cd2+，但Cd2+與細胞壁的官能團發(fā)生配位作用以及螯合作用[12,20]需要時間，因此隨著時間的延長，菌粉的吸附量逐漸增加。但過長的吸附時間會使吸附位點出現(xiàn)解析，吸附量下降，反而對吸附無益。因此菌粉吸附Cd2+的最佳時間是180 min。

2.2.4 初始質量濃度菌粉吸附Cd2+的影響

初始Cd2+質量濃度對菌粉吸附值得影響見圖2（d）。隨著初始Cd2+質量濃度上升，吸附量先上升后保持穩(wěn)定。在初始Cd2+質量濃度為300 mg/L 時，吸附量最大（195.2 mg/g）。隨著溶液中初始Cd2+質量濃度的增加，一方面溶液中Cd2+基數(shù)增加，與菌粉表面的可吸附位點碰撞的機率增大[21]，因此吸附量不斷增大。另一方面，當Cd2+質量濃度達到一定程度時能提供驅動力，以克服固相和液相的傳質阻力，從而提高吸附劑的吸附量[20]。但當Cd2+質量濃度繼續(xù)上升，吸附位點出現(xiàn)飽和狀態(tài)時，吸附量將不會再出現(xiàn)較大的變化。因此，最佳吸附點在Cd2+質量初始濃度為300 mg/L。

2.2.5 投加量對菌粉吸附Cd2+的影響

投加量對菌粉吸附Cd2+的影響見圖2（e）。隨著菌粉投加量的增多，菌粉的吸附量先急速下降后趨于穩(wěn)定。在投加量為0.2 g/L時菌粉出現(xiàn)最高點，LC 菌粉吸附量為105.6 mg/g。這是因為在Cd2+含量相同的溶液中，菌粉投加量越大，單位菌粉吸附Cd2+降低，并且在菌粉濃度較高時，Cd2+的有限、可吸附位點的相互干擾、甚至是靜電作用都會影響吸附過程，從而降低吸附量[22-23]。研究結果與Atena[24]的研究結果相似，最佳吸附點是投加量最少的點，隨著投加量的增多，吸附量反而降低。

2.3 LC 菌粉對Cd2+吸附條件優(yōu)化

正交試驗結果見表2。由表2可知，A 因素中K1＞K2＞K3，B 因素中K2＞K3＞K1，C 因素中K2＞K3＞K1，D 因素中K2＞K3＞K1，優(yōu)化吸附量應選每個因素中最大的水平，R越大表示該因素水平變化對實驗結果影響越大，反之越小[25]。從而最佳方案是A1B2C2D2，即最佳方案為：投加量0.1 g/L，時間2 h，溫度30 ℃，pH 值6.0。主次因素為A＞B＞D＞C，即投加量的影響對菌粉吸附Cd2+的影響最大，時間次之，溫度的影響最小。

2.4 菌粉對Cd2+的等溫吸附特性

LC 菌粉對Cd2+的吸附等溫線如圖3所示。隨著Cd2+質量濃度的升高，吸附量逐漸增大，當Cd2+質量濃度上升到400 mg/L 時，吸附量趨于穩(wěn)定。采用Langmuir 和Freundlich 等溫線模型進行擬合[26]，結果見圖3，相關擬合參數(shù)列于表3。

圖2 菌粉對Cd2+吸附的影響因素及規(guī)律分析Fig.2 Analysis of factors and regularity of bacterial powder adsorption on Cd2+

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experimental design and results

圖3 LC 菌粉對Cd2+吸附的Langmuir 和Freundlich 模型擬合Fig.3 Fitting of Langmuir and Freundlich models of Cd2+ adsorption by LC powder

表3 菌粉吸附Cd2+的等溫方程及相關參數(shù)Table 3 Isothermal equations and related parameters of adsorption of Cd2+ by bacterial powder

Langmuir 等溫吸附模型假設的是單層吸附，離子之間沒有相互作用，KL是表征結合位點與金屬離子的親和力相關的常數(shù)，常數(shù)越小，吸附親和力越大。生物吸附過程由qmax和KL共同決定的，一個好的生物吸附劑往往KL較低、qmax較高[27-28]。其還可以定義一個無量綱的分離因子

[29]，當RL=0，為非可逆吸附，RL=1 為可逆吸附。當0＜RL＜1，有利；當RL＞1，不利。對于Freundlich 等溫吸附模型，KF代表吸附常數(shù)，1/n與金屬離子濃度有關，值越大，表明吸附劑與吸附質之間的作用越強，1/n處于1～10 之間，吸附過程更加有利進行[30-31]。

LC 菌粉對Cd2+的吸附等溫線非線性擬合結果表明，兩種等溫線方程均能較好地擬合吸附過程。其中Langmuir 方程擬合效果更好，說明LC 菌粉表面的吸附位點分布均勻并對Cd2+的親和力相同，是一個單層面吸附的過程。本研究對LC 菌粉的Langmuir 模型擬合結果中qmax為221 mg/g，KL為0.007，0＜RL（0.151 5）＜1，F(xiàn)reundlich 模型擬合常數(shù)KF為6.573 9，1/n為1.842 9，共同印證了LC 菌粉是一種良好的吸附劑，具有較強的吸附能力。黃飛[16]發(fā)現(xiàn)Langmuir 模型更適合模擬死細胞的吸附過程，采用Langmuir 模型擬合Bacillus cereus對Cd2+的吸附過程，得到吸附最大值 31.95 mg/g，與本研究LC 菌粉擬合等溫線模型結果一致。沈秋悅[21]通過Langmuir 模型擬合Bacillus的吸附得到了菌株的吸附最大值1.83 mg/g。Loukidou[32]利用Aeromonas caviae作為生物吸附劑吸附溶液中的Cd2+，其最大吸附量可達155 mg/g。以上研究表明菌株類型不同，吸附量差異性較大。Bacillus、Bacillus cereus屬于革蘭氏陽性菌，Aeromonas caviae和LC 菌是革蘭氏陰性菌，革蘭氏陰性菌細胞壁含有脂多糖，其屬于聚合電解質，帶有較強的負電荷，可以通過靜電作用吸附Cd2+，而革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，且外膜成分缺失,吸附能力有所減弱[33]。

2.5 菌粉吸附Cd2+前后表征分析

2.5.1 掃描電鏡(SEM)分析

菌粉吸附Cd2+前后掃描電鏡結果如圖4所示，圖4a 為吸附前，圖4b 為吸附后，菌粉表面吸附前后出現(xiàn)變化。由圖4a 可知，吸附前菌粉表面較為平滑且飽滿，而吸附后圖4b 顯示菌粉表面部分凹凸不平，表明菌粉表面吸附Cd2+。

圖4 菌株吸附Cd2+前后電鏡掃描結果（10 000×）Fig.4 Electron microscopy results before and after adsorption of Cd2+ by strain (10 000×)

2.5.2 能譜（EDX）分析

吸附前后菌粉的能譜分析圖譜見圖5。由圖5可知：吸附前，菌粉表面存在C、O、Cl、Na、P、Mg 峰，菌粉表面的吸附位點被Mg2+與Na+占據(jù)。吸附后，菌粉表面出現(xiàn)了新Cd 峰，Na、Mg 峰消失，出現(xiàn)一個不明峰。表明Cd2+與Mg2+、Na+發(fā)生離子交換，吸附位點被Cd2+取代。吸附后出現(xiàn)的不明峰與吸附前P 峰的位置一致，且變強。這是因為P 存在與Cd2+的絡合作用，產生的基團占據(jù)了表面吸附位點。

圖5 菌粉吸附Cd2+前后的能譜Fig.5 Energy spectrum of bacterial powder before and after adsorbing Cd2+

2.5.3 紅外光譜（FTIR）分析

LC 菌粉吸附前后紅外光譜見圖6，根據(jù)相關文獻[30-35]，對比圖中LC 菌粉對Cd2+吸附前后的紅外光譜圖可知，吸附Cd2+后，位于 3 404.63 cm-1處的-OH 最大的吸收峰變窄，遷移至3 300.36 cm-1。在1 644.88 cm-1的吸收峰，是細胞蛋白質酰胺Ⅰ帶，遷移至1 654.80 cm-1且吸收峰變強，是酰胺基的 C=O 的伸縮振動引起。位于 1 541.65 cm-1是由于N-H 鍵彎曲振動產生，吸附后遷移至1 534.86 cm-1且吸收峰增強。位于1 235.34 cm-1處吸收峰可能是C-O、O-H、C-N 鍵伸縮振動引起，吸附后遷移至1 232.08 cm-1且吸收峰變窄變強。在1 078.24 cm-1處的吸收帶主要是由P=O、P-OH、PO43-等伸縮引起，吸附后遷移至1 064.04 cm-1且吸收峰變窄，相關研究表明磷酸基團只在死菌中參與對Cd2+的吸附，具有特異性[33]。位于 546.66 cm-1處的吸收峰是由C-N-S 的剪式彎曲振動引起，吸附后遷移至619.66 cm-1且吸收峰峰強度減弱。吸附前位于2 960.11、2 925.56 和2 853.33 cm-1的吸收峰是由蛋白質、糖類和物質中的C-H 鍵伸縮振動引起的，吸附后基團位置遷移不大，遷移至2 925.54 cm-1的吸收峰變強。綜上分析，菌粉中含有的羥基、羰基、酰胺基、磷酸基等基團均參與了Cd2+的吸附過程。

圖6 LC 菌粉吸附Cd2+前后的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra before and after Cd2+ adsorption by LC bacterial powder

3 結論與討論

從鎘污染土壤中篩選了一株耐鎘菌株，經16S rDNA 測序鑒定為羅爾斯通氏菌Ralstoniaspp.，菌株對Cd2+質量濃度的耐受閾值為850 mg/L。通過單因素試驗確定了菌粉對Cd2+的吸附規(guī)律，LC 菌粉對Cd2+的吸附量隨著溶液溫度的升高先增大后減小。隨著溶液初始pH 值的增大，其吸附量先增大后減小。隨著時間的延長，其吸附量先上升而后略微下降。隨著Cd2+初始質量濃度的增加，其吸附量先增大后基本穩(wěn)定。隨著投加量的增多，其吸附量先減少后趨于平衡。菌粉對Cd2+的最佳吸附條件為：投加量0.1 mg/L，吸附時間2 h，pH 值6.0，溫度30 ℃，在此條件下菌粉對Cd2+的吸附量可達198 mg/g。其中，投加量對菌粉吸附Cd2+的影響最大，溫度最小。LC 菌粉對Cd2+的吸附過程更符合Langmuir 等溫吸附模型，表明LC菌粉對Cd2+是一個單層面的吸附，飽和吸附量為221 mg/g。EDX 分析顯示吸附后LC 菌粉表面檢測到Cd2+的存在，表明LC 菌粉對Cd2+的吸附主要通過Cd2+與Na+、Mg2+發(fā)生離子交換；FTIR 分析表面LC 菌粉中含有的羥基、羰基、酰胺基、磷酸基等基團與Cd2+發(fā)生絡合作用。菌株的耐受閾值在耐鎘菌株中相對較高[19,21]，但不如皮氏羅爾斯通氏菌[14]，若研究活性菌株對Cd2+的生物積累作用，皮氏羅爾斯通氏菌將更具優(yōu)勢。而在本研究中，菌粉的吸附無須考慮菌株對重金屬的耐性，LC 菌粉的吸附量高達198 mg/g，在已有的干菌體研究中具有較高的吸附量[16,20]，為微生物修復提供了吸附能力強的功能菌株，但在實際應用中缺乏實踐，對于綜合廢水的污染修復能力有待考察，還需進行進一步試驗。