冷凍干燥乳雙歧桿菌A04菌粉的貯藏活性研究

王淑敏，桑 躍，侯彩云，王鵬杰，任發(fā)政，4，王 然*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心 河北廊坊065201 3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系 北京100091 4 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實驗室 北京100083）

2001年，益生菌被WHO/FAO 定義為：“活的微生物，當(dāng)給予足夠的量時，對宿主提供健康益處”[1]。目前已有大量的研究表明，攝入益生菌可降低某些癌癥的風(fēng)險，緩解乳糖不耐受，治療腹瀉和炎癥性腸病，增強免疫功能，降低血液膽固醇等[2-3]。此外，最近的研究表明，益生菌能夠通過腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)胃腸道和神經(jīng)精神疾病[4]。近年來，通過飲食改善健康的理念被越來越多人所接受，消費者對益生菌的興趣日益增加，益生菌食品和膳食補充劑受到歡迎。自2016年以來，全球益生菌的消費水平迅速增加，2018年總產(chǎn)值為494 億元，預(yù)計將以每年7%的速度增長，至2023年總產(chǎn)值達到693 億元[5]。

為了確保益生菌的益生作用，益生菌產(chǎn)品在貨架期終點時應(yīng)至少含有106個活細胞/g[6]。由于益生菌對各種脅迫條件非常敏感，在長時間保藏過程中，活性損失是益生菌產(chǎn)品面臨的主要問題，因此提供數(shù)量大的活細胞尤其具有挑戰(zhàn)性[7-8]。益生菌的貯藏穩(wěn)定性對于產(chǎn)品質(zhì)量非常重要。干燥的益生菌粉與液體制劑相比具有更好的穩(wěn)定性。目前，對于益生菌粉在貨架期的活性或穩(wěn)定性的研究尚不充分，已報道稱，溫度及水分是影響益生菌粉貨架期存活的重要因素[9]。較高的溫度會促進氧化反應(yīng)或引起膜脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變，從而不利于益生菌的存活[10]。而水分可以改變細菌代謝活性、物化反應(yīng)速率以及玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從而影響益生菌粉的貯藏穩(wěn)定性[11]。由于益生菌菌種/菌株的差異，益生菌粉在貯藏期間的活性或穩(wěn)定性也存在菌種/菌株特異性。此外，關(guān)于水分對益生菌粉貯藏穩(wěn)定性的研究均在水分活度恒定的基礎(chǔ)上進行，而在實際應(yīng)用過程中，通過采用隔水的包裝只能確保菌粉無法從外界環(huán)境吸附水分，不能保證貯藏期間菌粉的水分活度保持恒定。本文以乳雙歧桿菌A04 為研究對象，在益生菌干粉制劑實際應(yīng)用場景，探究冷凍干燥A04 菌粉在不同貯藏溫度條件下的水分活度、水分含量、水分分布和菌體形態(tài)的變化，以及這些變化對益生菌粉貯藏活性的影響，以期為提高A04 菌粉的貯藏穩(wěn)定性，促進益生菌產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

乳雙歧桿菌A04（Bifidobacterium lactisA04）為本實驗室分離與保存。脫脂乳，食品級，新西蘭恒天然集團；海藻糖，食品級，保齡寶生物股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

水分活度儀（LabSwift-Novasina），大昌華嘉科學(xué)儀器；低場核磁共振分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8020），日本日立公司；生化培養(yǎng)箱，潔凈工作臺、立式壓力蒸汽滅菌鍋、鼓風(fēng)干燥箱，上海飛越實驗儀器有限公司；冷凍干燥機，上海舜制儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冷凍干燥A04 菌粉制備 活化后的乳雙歧桿菌A04 以2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒pH 值（6.0）培養(yǎng)12 h 至穩(wěn)定期前期，3 500×g，4 ℃離心10 min 收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌2 次后，以1∶0.5 的比例重懸于10%脫脂乳和6%海藻糖混合無菌溶液中，混勻后于-80℃冷凍過夜，置于冷凍干燥機中干燥36 h，制備得到冷凍干燥A04 菌粉。本文研究選用了6 批不同初始活菌數(shù)的冷凍干燥A04 菌粉用于后續(xù)試驗，分別標記為A04 低-1、A04 低-2、A04 中-1、A04中-2、A04 高-1、A04 高-2。

1.3.2 貯藏試驗 將上述冷凍干燥菌粉樣品采用鋁箔袋密封包裝后分別置于4，25，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，于第30 天、50 天、105 天取樣進行后續(xù)測定。

1.3.3 水分含量及水分活度測定 冷凍干燥菌粉的水分含量測定參照AOAC 方法[12]。稱取2 g 干燥菌粉置于鋁盒中，于105 ℃條件下干燥直至恒重。菌粉樣品的水分含量以干基計，計算公式如下：

式中：m0——鋁盒質(zhì)量，g；m1——烘干前盛有樣品的鋁盒質(zhì)量，g；m2——烘干后盛有樣品的鋁盒質(zhì)量，g。

干燥菌粉的水分活度采用水分活度儀進行測定。

1.3.4 活菌計數(shù) 采用平板計數(shù)法測定貯藏期間A04 菌粉的活菌數(shù)。稱取1 g 干燥菌粉分散于9 mL 無菌生理鹽水中，隨后進行梯度稀釋，最后取1 mL 樣液涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。A04 菌粉的存活率以lgNt/N0表示，其中Nt表示貯藏時間為t時的活細胞數(shù)，N0即0 d時的活細胞數(shù)。

1.3.5 皮爾遜相關(guān)性分析 皮爾遜相關(guān)性分析是度量兩個或多個變量之間關(guān)系密切程度的統(tǒng)計學(xué)方法。采用SPSS 20 對貯藏試驗監(jiān)測結(jié)果進行相關(guān)性分析，得到相關(guān)系數(shù)r及顯著性水平P。一般情況下，r的取值在（-1，1）之間，相關(guān)程度可分為高度相關(guān)（|r|≥0.8）、中度相關(guān)（0.5≤|r|<0.8）、低度相關(guān)（|r|<0.3）。其中r為負值時表示負相關(guān)，正值時表示呈正相關(guān)關(guān)系。P<0.05 表示有顯著差異，P<0.01 表示有極顯著差異。

1.3.6 水分分布 采用低場核磁PQ-001 分析儀測定A04 菌粉在貯藏期間的水分分布情況。稱取1 g 干燥菌粉置于固體樣品測試管中，采用CPMG序列在32 ℃條件下進行，測試參數(shù)參照Wang 等[13]的報道并稍作修改：儀器主頻SF=18 MHz；90度脈寬P1=5 μs；采樣點數(shù)TD=4 078；采樣等待時間TW=300 ms；180 度脈寬P2=9 μs；前置放大倍數(shù)PRG=3；回波個數(shù)NECH=200/300；回波時間TE=0.101；采樣頻率SW=200；射頻延時RFD=0.2 ms；模擬增益RG1=20 db；數(shù)字增益DRG1=3；累加次數(shù)NS=128。數(shù)據(jù)采集和分析采用MultiExpInvfit-T 軟件，然后根據(jù)得到的原始數(shù)據(jù)的對數(shù)坐標構(gòu)建T2 分布曲線。

1.3.7 微觀形態(tài)分析 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察A04 菌粉的微觀形貌[14-15]。稱取0.1 g 干燥菌粉于10 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）中洗滌2次，經(jīng)3 500×g，4 ℃離心10 min 后，收集細胞，用2%戊二醛溶液固定過夜，然后在乙醇溶液中梯度脫水：25%，50%，70%（過夜），90%，95%和100%（3 次），最后在CO2臨界點處干燥，制備的樣品通過導(dǎo)電膠固定在鋁試樣盤上，用直流濺射法進行噴金處理后進行微觀形貌觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同批次制備的冷凍干燥A04 菌粉

為了分析冷凍干燥A04 菌粉的貯藏活性，選取了6 個批次制備得到的A04 菌粉進行貯藏試驗。如表1所示，6 批A04 菌粉的水分含量均位于5.2%～6.2%之間；除A04 高-1 菌粉水分活度值偏高接近于0.1 外，其余5 個批次A04 菌粉水分活度值均處于較低水平（0.03～0.06 之間）。從活菌數(shù)的角度來看，6 批冷凍干燥A04 菌粉活菌數(shù)均較高，達到1011～1012CFU/g。

表1 不同批次冷凍干燥A04 菌粉的初始參數(shù)Table 1 The initial parameters of different batches of freeze-dried A04 powders

2.2 冷凍干燥A04 菌粉在不同貯藏溫度下活菌數(shù)的變化

溫度是影響干燥菌粉在貯藏期間存活的一個關(guān)鍵因素[9]。如圖1所示，A04 菌粉在貯藏期間的活菌數(shù)均隨著貯藏時間的增加而減少；且活菌數(shù)與貯藏溫度呈負相關(guān)，這與Wang 等[6]的研究結(jié)果相一致。當(dāng)溫度≥25 ℃時，活菌數(shù)隨著貯藏溫度的升高而顯著下降，這可能是由于在較高溫度下的貯藏導(dǎo)致細菌細胞膜脂質(zhì)氧化或發(fā)生膜脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變，從而不利于細菌存活[16]。而在冷藏溫度（4 ℃）下，A04 菌粉具有較好的貯藏穩(wěn)定性，這是由于較低的溫度條件下，微生物的代謝活性以及不利的物化反應(yīng)速率較低[17]。表2 列出了不同貯藏溫度下A04 菌粉在貯藏105 d 過程中的滅活率常數(shù)，6批A04 菌粉貯藏期間的滅活率不盡相同，其中A04 高-1 菌粉在貯藏期間對溫度更加敏感，隨著貯藏時間的增加，活菌數(shù)顯著下降，其在4，25，37℃的滅活率常數(shù)分別為-4.1591×10-5，-1.3868×10-4，-7.4490×10-4；而A04 中-1 菌粉對溫度敏感性最低，相應(yīng)的滅活率常數(shù)分別為-2.3214×10-5，-1.4484×10-4，-2.0943×10-4。這說明益生菌粉的貯藏活性不僅與菌株有關(guān)，與菌粉的初始參數(shù)也存在一定的相關(guān)性。

表2 不同貯藏溫度下冷凍干燥A04 菌粉的滅活率常數(shù)Table 2 Inactivation rate constant（k）of freeze-dried A04 powders at various storage temperatures

圖1 不同批次冷凍干燥A04 菌粉貯藏期間的活菌數(shù)變化Fig.1 Changes of viable cell counts during storage of freeze-dried A04 powders

2.3 冷凍干燥A04 菌粉貯藏期間水分含量的變化

益生菌粉的貯藏穩(wěn)定性在很大程度上受到水分的影響。水分含量和水分活度是表征食品中水分的兩個重要指標，前者表示食品體系中總的水分含量，而后者則表示食品體系中可進行生化、生物和生理反應(yīng)的水分含量。如圖2所示，貯藏期間A04 菌粉的水分含量在5.2%～6.2%之間，隨著貯藏溫度的增加未發(fā)生顯著變化，即貯藏過程中A04 菌粉的總水分水平未發(fā)生變化。這說明采用的鋁箔袋包裝具有良好的阻水性，可以防止菌粉在貯藏期間從環(huán)境中吸附水分。

圖2 冷凍干燥A04 菌粉4，25，37 ℃貯藏期間水分含量的變化Fig.2 Changes in moisture content of freeze-dried A04 powders during storage at 4，25，37 ℃

2.4 冷凍干燥A04 菌粉貯藏期間水分活度的變化

A04 菌粉在不同貯藏溫度下水分活度的變化如圖3所示，在4 ℃貯藏105 d 期間，A04 菌粉的水分活度未發(fā)生明顯增加；在25 ℃貯藏30 d 時，A04 菌粉的水分活度顯著增加，而在隨后的貯藏過程中，水分活度緩慢增加或保持相對穩(wěn)定。在37 ℃貯藏105 d 過程中水分活度的變化趨勢與25℃一致，但水分活度值均高于25 ℃相應(yīng)的水分活度。這說明貯藏期間水分活度的變化與貯藏溫度有關(guān)，在較低溫度下A04 菌粉比較穩(wěn)定，而在較高的溫度條件下水分活度的增加可能是由于A04 菌粉中水分子與親水基團之間分子鍵的斷裂所致[18]。本研究中，A04 菌粉中添加的干燥基質(zhì)（海藻糖、脫脂乳粉）可能與貯藏期間水分活度的增加有關(guān)，因為碳水化合物和蛋白質(zhì)等親水分子中含有較多的親水基團以及氫鍵等化學(xué)鍵[19]。此外，在所有貯藏溫度下，A04 中-1 菌粉的水分活度值最低，A04 高-1 菌粉水分活度值最高，這可能與其初始（0 d）的水分活度值有關(guān)。

圖3 4，25，37 ℃貯藏期間冷凍干燥A04 菌粉水分活度的變化Fig.3 Changes in water activity of freeze-dried A04 powders during storage at 4，25，37 ℃

2.5 A04 菌粉貯藏試驗結(jié)果Pearson 相關(guān)性分析

為了探討貯藏溫度、菌粉水分活度對貯藏期間A04 菌粉存活的影響，對貯藏試驗結(jié)果進行了皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。貯藏期（30，50，105 d）損失活菌數(shù)與貯藏溫度呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.888，0.820 和0.748）。目前已有大量研究證實，干燥的益生菌培養(yǎng)物在貯藏期間的死亡與較高的貯藏溫度有關(guān)[6]。De 等[20]研究顯示，微膠囊化鼠李糖乳桿菌在7 ℃貯藏120 d 后活細胞數(shù)減少1 lg（CFU/g），但在25 ℃貯藏相同時間后活細胞減少了1.5 lg（CFU/g）。對于益生菌粉來說，較低的貯藏溫度（冷凍或冷藏）有利于其貯藏期間的存活。然而，由于當(dāng)前食品及醫(yī)藥行業(yè)市場對即食食品的需求，益生菌粉需要在室溫下保持穩(wěn)定，因此，降低益生菌對溫度的敏感性是提高益生菌粉貯藏活性或穩(wěn)定性的一個可行策略。

表3 冷凍干燥A04 菌粉水分活度、初始菌數(shù)、貯藏溫度與活菌數(shù)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between water activity,initial bacterial counts,storage temperature and viable cell counts of freeze-dried A04 powders

貯藏30 d 及50 d 時，A04 菌粉損失活菌數(shù)與相應(yīng)貯藏期水分活度顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.690，0.639）；貯藏105 d 時，損失活菌數(shù)與水分活度呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.713）。此外，貯藏期（30，50，105 d）水分活度與初始水分活度也呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.764，0.813 和0.872）。從相關(guān)性分析結(jié)果可知，A04 菌粉的初始及貯藏期水分活度對益生菌貯藏期間的存活具有顯著影響。不論貯藏溫度如何，A04 高-1菌粉的水分活度均不低于0.1，明顯高于其它批次A04 菌粉，導(dǎo)致貯藏活性顯著降低。研究表明，較低的水分活度往往伴隨著較低的代謝活性、物化反應(yīng)速率以及較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[21-22]。此外，貯藏期間酶活性的保持也依賴于貯藏期間的水分活度[7]。因此，維持較低的水分活度（＜0.1）有利于提高A04 菌粉的貯藏穩(wěn)定性。但是水分活度與貯藏穩(wěn)定性之間并非始終呈負相關(guān)關(guān)系，過低的水分活度值或過度干燥不利于益生菌粉的貯藏穩(wěn)定性[23]。已有研究證實過度干燥會導(dǎo)致細菌較高的死亡率[17]。維持合適的水分活度有助于延長益生菌粉的貨架期，本研究中，A04 菌粉的水分活度貯藏期間保持在0.03～0.1 之間時具有較好的貯藏穩(wěn)定性。

2.6 冷凍干燥A04 菌粉貯藏期間水分分布的變化

根據(jù)上述貯藏試驗結(jié)果，A04 中-1 菌粉具有較好的貯藏穩(wěn)定性。為了進一步分析貯藏期間水分活度增加的原因，對A04 中-1 菌粉在4，25，37℃貯藏期間的T2 弛豫曲線以及水分分布進行了分析，結(jié)果如圖4所示。從圖4d 中可以看出，在貯藏期間A04 菌粉中結(jié)合水的含量均高于90%，這是由于干燥A04 菌粉的水分含量較低，水分主要以結(jié)合水的形式存在。在4 ℃貯藏期間，A04 菌粉中結(jié)合水含量稍有降低；而在25 ℃及37 ℃貯藏期間，A04 菌粉中結(jié)合水含量隨著貯藏時間的增加明顯降低，這表明在貯藏期間A04 菌粉中水分可能發(fā)生了轉(zhuǎn)變，一部分結(jié)合不牢固的結(jié)合水轉(zhuǎn)化為不易流動水或自由水，從而導(dǎo)致菌粉在貯藏過程中水分活度顯著增加，而水分含量未發(fā)生明顯變化。此外，在貯藏期間隨著貯藏溫度的增加，A04 菌粉中結(jié)合水含量降低，這說明水分子轉(zhuǎn)化（遷移）與貯藏溫度呈正相關(guān)，溫度越高，水分子運動速率越快。微生物細胞周圍水分子的遷移（轉(zhuǎn)化）影響其在貯藏期間的存活，因此，為了更好地保藏干燥菌粉，貯藏期間的水分活度需要控制在較低的水平（＜0.1）且保持相對恒定。

圖4 在4 ℃（a）、25 ℃（b）、37 ℃（c）貯藏期間冷凍干燥A04 菌粉的T2 弛豫曲線和結(jié)合水含量（d）的變化Fig.4 Changes of T2 relaxation curve during storage at 4 ℃（a）,25 ℃（b）,37 ℃（c）and bound water content（d）of A04 freeze-dried powder

2.7 冷凍干燥A04 菌粉貯藏期間菌體形態(tài)的變化

A04 菌粉在不同溫度（4，25，37 ℃）條件下貯藏0～105 d 的菌體形態(tài)如圖5所示。在貯藏過程中觀察到A04 細胞包膜的損傷，且隨著貯藏溫度及貯藏時間的增加細胞損傷程度增大，甚至出現(xiàn)部分細胞裂解現(xiàn)象。在貯藏0 d 時，大部分菌體細胞飽滿且表面光滑，無明顯細胞變形。在4 ℃貯藏105 d 期間，菌體形態(tài)未發(fā)生顯著變化，細胞表面僅出現(xiàn)輕微皺縮現(xiàn)象。在25 ℃條件下，隨著貯藏時間的增加，細胞表面出現(xiàn)明顯皺縮，貯藏105 d時（圖5e）可觀察到部分菌體細胞表面有明顯的孔洞出現(xiàn)。37 ℃條件下貯藏50 d（圖5f）時觀察到部分菌體細胞表面出現(xiàn)孔洞，貯藏105 d 時菌體形態(tài)損傷程度加大，部分菌體細胞開始裂解。這表明貯藏期間A04 細胞表面發(fā)生變形，隨著貯藏溫度及時間的增加，細胞從皺縮變形、出現(xiàn)孔洞到開始裂解，菌體形態(tài)的這種損傷最后導(dǎo)致A04 細胞死亡。Nag 等[24]也發(fā)現(xiàn)在貯藏過程中菌體細胞表面出現(xiàn)變形。此外，有研究指出，細菌細胞的皺縮變形與細胞完整性的喪失、代謝活性以及存活具有相關(guān)性[25]。

圖5 貯藏期間冷凍干燥A04 菌粉菌體形態(tài)的變化（20 000X）Fig.5 Changes of bacterial morphology during storage of A04 freeze-dried powder（20 000X）

3 結(jié)論

益生菌粉在貨架期的穩(wěn)定存活對于其發(fā)揮益生作用，以及益生菌行業(yè)的發(fā)展均具有重要意義。本試驗以乳雙歧桿菌A04 為研究對象，探討冷凍干燥A04 菌粉在不同貯藏溫度下的水分特性、菌體形態(tài)的變化及這些變化對菌株存活的影響。結(jié)果顯示，A04 菌粉貯藏期間的存活與貯藏溫度、水分活度顯著負相關(guān)。當(dāng)貯藏溫度高于25 ℃時，A04菌粉的存活率顯著下降。此外，貯藏期間菌粉中部分結(jié)合水轉(zhuǎn)化成不易流動水或自由水，導(dǎo)致水分活度顯著增加，這與較高的貯藏溫度以及干燥基質(zhì)組分有關(guān)。研究結(jié)果表明，水分活度是影響益生菌粉貯藏活性的一個關(guān)鍵因素，在貯藏過程中，維持合適的水分活度（0.03～0.1）有利于A04 的存活，同時保持水分活度的穩(wěn)定對于A04 菌粉的貯藏穩(wěn)定性也十分重要。本研究首次以益生菌粉制劑實際應(yīng)用場景為基礎(chǔ)，監(jiān)測益生菌粉的貯藏活性，這為益生菌粉的實際生產(chǎn)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

在益生菌粉產(chǎn)品的生產(chǎn)中，應(yīng)優(yōu)化干燥工藝，明確制備穩(wěn)定益生菌粉的加工參數(shù)；并以貯藏活性或穩(wěn)定性為指標，篩選干燥基質(zhì)及賦形劑，確定有利于干燥菌粉貯藏的水分活度，將有利于制備室溫條件下長時間保藏的益生菌粉制劑，促進益生菌產(chǎn)品的開發(fā)及大規(guī)模應(yīng)用。