果實角質(zhì)層研究進展

劉港帥，李泓利，田慧琴，傅達奇

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 果實生物學(xué)實驗室 北京100083）

角質(zhì)層是水生植物向陸生植物的進化過程中，為適應(yīng)陸地相對干燥、溫度波動范圍大、紫外輻射強烈等環(huán)境特點，由植物氣生器官表皮細胞合成并覆蓋于其表面的一層疏水性結(jié)構(gòu)。它可將植物的氣生器官與外界脅迫因素相對隔離，從而保護植株正常的生長發(fā)育[1]。由于研究方法的缺乏，在過去很長一段時間，植物角質(zhì)層的重要性被忽視。目前，植物角質(zhì)層的研究受到廣泛關(guān)注，但大多數(shù)的研究集中于模式植物擬南芥、番茄等的營養(yǎng)器官，對于果實角質(zhì)層的研究不夠深入、全面，而果實角質(zhì)層對果實的生理狀態(tài)和品質(zhì)形成具有重要的調(diào)節(jié)作用，例如可有效抵御外界病蟲害，平衡果實內(nèi)部膨壓，減緩果實采后失水[2]，因此研究果實角質(zhì)層可為提高果實采前品質(zhì)和采后貯藏性能提供重要的理論基礎(chǔ)。本文整理近年來的文獻報道，對果實角質(zhì)層的組成、功能、生物合成、調(diào)控及研究方法5 個方面進行綜述，為未來果實角質(zhì)層的深入研究提供研究思路。

1 果實角質(zhì)層的組成

果實角質(zhì)層主要由角質(zhì)基質(zhì)和覆蓋并嵌入其中的蠟質(zhì)兩部分組成[3-4]。角質(zhì)是由羥基化或環(huán)氧羥基化的脂肪酸（C16和C18，其中C16主要是9，16-二羥基棕櫚酸和10，16-二羥基棕櫚酸，C18主要是9，10，18-三羥基硬脂酸和9，10-環(huán)氧，18-羥基硬脂酸）共價連接而形成的聚酯[5-6]。蠟質(zhì)是由長鏈和超長鏈脂肪酸及其烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、三萜類、甾醇類化合物等各類衍生物所組成的混合物[3]。此外，角質(zhì)層還含有一定數(shù)量的酚類化合物和來源并定位于表皮細胞細胞壁，整合在角質(zhì)基質(zhì)中的多糖[7-8]。一些果實的角質(zhì)層中還可能含有無法水解的膠膜，這是一類由脂肪族化合物通過醚鍵連接形成的非酯網(wǎng)狀核心基質(zhì)[9]。在植物的不同物種之間和相同植物的不同器官之間，角質(zhì)和蠟質(zhì)的含量及其組成成分都存在差異[1]。不同種類果實角質(zhì)層中的角質(zhì)主要單體和蠟質(zhì)主要成分在之前的研究中已被先后分析闡明，并在Lara 等[3]的綜述中進行了詳細匯總。

2 果實角質(zhì)層的功能

2.1 抵御非生物和生物脅迫

果實角質(zhì)層的主要功能之一是抵御內(nèi)部和外界非生物和生物脅迫，在果實的發(fā)育和成熟階段，果實角質(zhì)層通過調(diào)整自身結(jié)構(gòu)和成分以承受果實不斷膨大和細胞壁降解所帶來的內(nèi)部膨壓，以保持果實的完整性[2]。此外，果實角質(zhì)層作為一種天然屏障將果實與外界環(huán)境相對隔離，其中，角質(zhì)、多糖、酚類物質(zhì)分別為角質(zhì)層提供延展性、剛度、硬度等機械性能。同時，蠟質(zhì)（主要為其中的烷烴）和多糖可以增加果實的持水能力。蠟質(zhì)和酚類物質(zhì)可以過濾紫外線。而角質(zhì)和蠟質(zhì)又可作為一種溫度調(diào)節(jié)器，維持植物體自身的溫度穩(wěn)定[3，10]。因此果實角質(zhì)層有利于避免或減輕例如干旱、紫外線輻射、溫度波動、各類病蟲害、機械擠壓和碰撞等外界脅迫對果實本身造成的傷害，這種保護作用可能還與角質(zhì)層對外界信號的敏感性相關(guān)，角質(zhì)層通過接收外界信號并轉(zhuǎn)導(dǎo)至植物體內(nèi)以激活植物體內(nèi)的生理應(yīng)答，進而增強植物體對各類外界脅迫的抗性[11-13]。

2.2 減緩果實采后失水

另一方面，近年的研究表明，果實角質(zhì)層對于調(diào)控果實的采后品質(zhì)也具有重要的作用[2]。在果實的采后貯藏過程中，失水是導(dǎo)致其品質(zhì)劣變的重要因素，而果實水分損失程度的主要決定因素之一是覆蓋于果實外表皮的角質(zhì)層[14-15]?！癲elayed fruit deterioration（dfd）”基因型的番茄果實由于其果實角質(zhì)層的組成和性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致角質(zhì)層透性降低，果實的持水能力增強，從而延緩了采后果實的軟化和品質(zhì)劣變[14]。Romero 等[16]發(fā)現(xiàn)，水分脅迫條件誘導(dǎo)“Ailsa Craig（AC）”和“M82”番茄果實上調(diào)了角質(zhì)層生物合成相關(guān)基因的表達，導(dǎo)致角質(zhì)層含量增加，并降低了角質(zhì)層的透性，因此降低了采后果實的蒸騰速率，進而延緩了果實的軟化，在一定程度上延長了“AC”和“M82”番茄果實的貨架期。柑橘果實表皮的角質(zhì)層可防止水分流失、抵御外界微生物侵入、調(diào)節(jié)生理代謝，從而有效保護柑橘果實的采后貯藏品質(zhì)[17]。在生產(chǎn)中，也經(jīng)常通過在果實表面打蠟以減少果實采后的水分損失，從而延長果實的采后貯藏期[18]。一些轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用也證實果實角質(zhì)層與果實采后失水密切相關(guān)。羅志丹[19]利用RNAi（RNA interference，RNAi）技術(shù)沉默“中蔬6 號”番茄中一個非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白（nsLTP），發(fā)現(xiàn)nsLTP沉默會影響角質(zhì)層生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因CYP86和MS2的表達模式，并與參與角質(zhì)層形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CD2 互作來調(diào)控番茄果實蠟質(zhì)的合成與沉積，nsLTP沉默株系番茄果實角質(zhì)層蠟增厚，蠟質(zhì)組分與野生型相比存在明顯差異，且在采后貯藏階段失水率較低，表現(xiàn)出良好的持水性。轉(zhuǎn)錄因子FUL1 和FUL2 屬于MADS-box 家族，參與番茄果實成熟調(diào)控且功能冗余，利用RNAi 技術(shù)共沉默“Micro-Tom”番茄果實中的FUL1和FUL2，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系番茄果實的角質(zhì)層代謝發(fā)生改變，且與野生型果實相比，轉(zhuǎn)基因株系果實的采后失水率增加[20]。同時，最近的研究發(fā)現(xiàn)，果實角質(zhì)層的組成、結(jié)構(gòu)和特性在果實采后處于一個動態(tài)的變化過程，不同果實種類及同一種類不同品種之間，角質(zhì)層的動態(tài)變化過程都存在明顯差異，并顯著影響果實采后的貯藏性能[21-25]。

3 果實角質(zhì)層的生物合成

3.1 脂肪酸的生物合成

脂肪酸是角質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的共同前體，通過從頭合成途徑在質(zhì)體中合成，其中，脂肪酸合酶系統(tǒng)（FAS，一種多酶復(fù)合體，包括1 種酰基載體蛋白（ACP）和6 種酶：乙酰CoA：ACP ?；D(zhuǎn)移酶（AT）、丙二酸單酰CoA：ACP 轉(zhuǎn)移酶（MT）、β-酮脂酰-ACP 合酶（KS）、β-酮脂酰-ACP 還原酶（KR）、β-羥脂酰-ACP 脫水酶（HD）、烯酯酰-ACP還原酶（ER））為該生物合成途徑的主要催化工具。下面對脂肪酸前體的生物合成途徑作簡要概述（圖1）。

圖1 脂肪酸前體的生物合成途徑[26-29]Fig.1 Biosynthetic pathway of fatty acid precursors[26-29]

首先，乙酰CoA 在乙酰CoA 羧化酶的作用下生成丙二酸單酰CoA，然后在FAS 作用下，乙酰CoA 轉(zhuǎn)化為乙酰-ACP（AT 催化），丙二酸單酰CoA 轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰-ACP（MT 催化）。此后先后經(jīng)歷乙酰-ACP 和丙二酸單酰-ACP 的縮合（KS催化）、乙酰乙酰-ACP 的還原（KR 催化）、D-3-羥基丁酰-ACP 的脫水（HD 催化）、烯酯酰-ACP 的還原（ER 催化）這四個過程生成丁酰-ACP。丁酰-ACP 重復(fù)經(jīng)歷上述縮合、還原、脫水、還原這四個循環(huán)過程而不斷獲得丙二酸單酰-ACP 的二碳單位，進而形成C16和C18等長鏈脂肪酸。其中飽和的C16和C18脂肪酸為蠟質(zhì)生物合成的主要前體，C16：0和C18：x羥基脂肪酸為角質(zhì)生物合成的主要單體[26-29]。

3.2 角質(zhì)的生物合成

角質(zhì)單體的生物合成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行，首先C16和C18前體通過酰基-ACP 硫酯酶去除ACP，再通過長鏈酰基-CoA 合成酶（LACS）連接CoA 進行活化[27-28，30]。角質(zhì)生物合成的前體長鏈脂肪酸向角質(zhì)單體轉(zhuǎn)化的過程中，細胞色素P450 酶家族催化了轉(zhuǎn)化過程中羥基化和環(huán)氧化過程，其中CYP77A，CYP86A 和CYP94B 亞家族負責(zé)鏈中和鏈末端的羥基化過程[31-35]。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶如GPAT6 負責(zé)角質(zhì)單體向單脂酰甘油轉(zhuǎn)化[36]，而單脂酰甘油通過ABCG 運載體如ABCG36 和ABCG42 被轉(zhuǎn)運至胞外（未酯化的ω-羥基十六烷酸和十六烷二酸也可作為潛在的角質(zhì)前體被轉(zhuǎn)運至胞外）[37]，隨后在定位于胞外的?；D(zhuǎn)移酶如CD1/GDSL1/CUS1 的作用下連接到已有角質(zhì)聚合體游離的ω-羥基上，形成酯鍵，這個過程需要消耗ATP。而角質(zhì)聚合單鏈中的鏈中羥基則參與酯鏈間的交叉連接從而形成最終的復(fù)雜網(wǎng)狀聚合物結(jié)構(gòu)[6，38-41]。主要存在于質(zhì)膜附近和外層表皮細胞壁的角質(zhì)小體也被發(fā)現(xiàn)參與角質(zhì)的生物合成，角質(zhì)小體是由酯化的角質(zhì)單體形成的自組裝粒子，主要在果實發(fā)育前期的細胞分裂階段參與角質(zhì)的形成，并為細胞膨大階段依賴于?；D(zhuǎn)移酶的進一步角質(zhì)聚合提供模板[41]。同時，近期研究發(fā)現(xiàn)，聚合角質(zhì)可在角質(zhì)：角質(zhì)脂肪酸內(nèi)轉(zhuǎn)酰酶（CCT）的作用下發(fā)生裂解與重組[42]，在角質(zhì)：木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（CXT）的作用下與表皮細胞壁多糖形成共價連接[43]（圖2）。

3.3 蠟質(zhì)的生物合成

在蠟質(zhì)的生物合成過程中，C16和C18前體同樣需要通過?；?ACP 硫酯酶和LACS 活化為脂酰CoA 的形式，才能進一步在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)延長為超長鏈脂肪酸[27-28，30]。脂肪酸延長酶（FAE，一種多酶復(fù)合物，主要包括β-酮脂酰-CoA 合成酶（KCS）、β-酮脂酰-CoA 還原酶（KCR）、β-羥脂酰-CoA 脫水酶（HCD）、烯脂酰-CoA 還原酶（ECR）)為脂肪酸前體進一步延長的主要工具?；罨蟮闹oA 在ATP 存在的情況下，先后經(jīng)歷與丙二酸單酰CoA縮合（KCS 催化）、還原（KCR 催化）、脫水（HCD 催化）、還原（ECR 催化）這四個類似于脂肪酸從頭合成途徑的循環(huán)過程，從而不斷獲得丙二酸單酰CoA 的二碳單位以形成長鏈及超長鏈脂肪酸。而超長鏈脂肪酸可以通過脫羰基途徑和?；€原途徑形成醛、烴、醇、酮、酯、三萜、甾醇等各類衍生物，即蠟質(zhì)的主要成分[44-46]。目前，SlCER6[47-48]和StKCS6[49]被報道分別參與番茄果實和馬鈴薯塊莖表皮蠟質(zhì)的生物合成，其編碼一個蠟質(zhì)生物合成過程中的KCS，優(yōu)先負責(zé)C28以上脂肪酸鏈的延長。而CsCER1和CsWAX2/CER3可能參與脫羰基途徑，在黃瓜果實角質(zhì)層尤其是超長鏈烷烴的生物合成中起到重要作用[50-51]。SlTTS1和SlTTS2被報道編碼番茄中兩個氧鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclases，OSCs），其負責(zé)三萜生物合成的第一步，催化環(huán)氧角鯊烯環(huán)化成各種三萜醇異構(gòu)體。酵母表達系統(tǒng)和番茄的過表達系統(tǒng)分析表明，SlTTS1 是一種產(chǎn)物特異性的β-amyrin 合成酶，而SlTTS2 是一種多功能的OSC，其主要產(chǎn)物為δamyrin[52]（圖2）。蘋果中鑒定出的MdOSC1、MdOSC4、MdOSC5和CYP716A175參與蘋果果實三萜類物質(zhì)的生物合成并控制三萜類產(chǎn)物的相對比例，其中MdOSC1、MdOSC2、MdOSC3 均為多功能的OSC，而CYP716A175 是一個多功能的三萜C-28 氧化酶，負責(zé)將三萜氧化為各類三萜酸[53]。

圖2 角質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成途徑[6，27-28，30-53]Fig.2 Biosynthetic pathway of cutin and wax[6，27-28，30-53]

3.4 果實角質(zhì)層形成的候選基因

果實角質(zhì)層生物合成途徑除上述已經(jīng)闡明的部分，目前通過生物信息學(xué)比對、多組學(xué)聯(lián)合、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）等多種分析技術(shù)，獲得了許多參與果實角質(zhì)層形成的候選基因，例如黃瓜中的CsCER4[54]，甜櫻桃中的PaWINA、PaWINB、PaLipase、PaLTPG1、PaATT1、PaLCR、PaGPAT4/8、PaLACS1、PaLACS2、PaCER1[55]，越桔中的CER26-like、FAR2、CER3-like、LTP、MIXTA、BAS[56]，棗中的BCCP2[57]，蘋果中的CER1、CER2、CER4、CER10、LACS2、KCS7/2、LCR、FDH、PAS2、WBC11、LTPG1、WIN1、SHINE2、MYB30[58-64]，柑橘中的KCS6、CER3、CER1-1、MYB96、GL1-like[65-66]，芒果中的MiSHN1、MiCD2、MiCER1、MiCER2、MiCER3、MiKCS2、MiKCS6、MiWBC11、MiLTP1、MiLTP2、MiLTP3、MiLTPG1、MiCUS1、MiCUS2、MiPEL1[24]，番茄中的SlSHN1、LIN5[67-68]，這些基因被預(yù)測在果實角質(zhì)層生物合成中發(fā)揮重要作用，但仍需通過轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)手段進一步驗證其功能。

4 果實角質(zhì)層的調(diào)控

直接參與果實角質(zhì)層生物合成過程的關(guān)鍵基因在前述內(nèi)容已經(jīng)進行介紹，本節(jié)主要綜述近年來報道的轉(zhuǎn)錄因子及植物激素層面對果實角質(zhì)層形成的調(diào)控作用。

4.1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

在果實發(fā)育和成熟的進程中，果實角質(zhì)層的成分和結(jié)構(gòu)處于一個動態(tài)的變化過程，這是果實角質(zhì)層代謝相關(guān)基因時空特異性表達的綜合結(jié)果，而這種基因的時空特異性表達很大程度上取決于轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此，對角質(zhì)層代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及其靶基因的鑒定是未來果實角質(zhì)層研究中的重點內(nèi)容。隨著近年基因編輯、角質(zhì)層分析等生物技術(shù)的快速發(fā)展，在角質(zhì)層代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究上也取得了一定進展。例如，HDZip IV 家族中的CD2 是第一個在番茄果實中通過圖位克隆鑒定的參與角質(zhì)層代謝的轉(zhuǎn)錄因子，其可能通過對角質(zhì)裝配過程中關(guān)鍵基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而參與角質(zhì)層代謝?！癱d2”突變體番茄果實角質(zhì)層的角質(zhì)含量降低了95%～98%[69-71]。同時在番茄果實中，AP2 家族的轉(zhuǎn)錄因子SHN3 也被證明通過調(diào)控角質(zhì)層代謝和表皮細胞結(jié)構(gòu)的一系列相關(guān)基因參與果實角質(zhì)層的發(fā)育，SHN3 在綠熟期番茄果實的外果皮表達活躍，沉默SHN3 會導(dǎo)致番茄果實角質(zhì)層中角質(zhì)和蠟質(zhì)含量顯著降低[72-73]。此外，Giménez 等[74]通過RNAi 技術(shù)大幅降低MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子TAGL1 在番茄果實中的豐度，發(fā)現(xiàn)TAGL1 沉默顯著影響番茄果實的角質(zhì)層發(fā)育，沉默株系果實角質(zhì)層的厚度、剛度及角質(zhì)層主要組分（角質(zhì)、蠟質(zhì)、多糖、酚類化合物）含量顯著降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)，TAGL1 通過調(diào)控番茄果實中CD2、CER6、SHN1、SHN3等角質(zhì)層合成中關(guān)鍵基因的表達以參與番茄果實角質(zhì)層的發(fā)育。此外，MIXTA-like 被發(fā)現(xiàn)是番茄果實角質(zhì)層形成的一個正調(diào)控因子，相較于野生型果實，MIXTA-like-RNAi 果實角質(zhì)層厚度顯著降低，果實的采后失重率顯著升高，抗病能力下降，表皮細胞模式出現(xiàn)缺陷，進一步研究表明，MIXTA-like作用于SHN3 的下游，并通過調(diào)控CYP77A和CYP86A亞家族、LACS2、GPAT4、ATP-BINDING CASSETTE11的表達水平促進番茄果實的角質(zhì)層形成[75]。將近年來報道的對不同果實角質(zhì)層形成有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子及其功能、靶基因和間接調(diào)控的基因匯總為表1。

表1 果實角質(zhì)層形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Table 1 Transcription factors related to cuticle formation in fruits

4.2 植物激素調(diào)控

在果實發(fā)育和成熟的過程中，果實內(nèi)部植物激素的水平也在不斷變化，果實角質(zhì)層的發(fā)育除了受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，在一定程度上也受到植物激素的調(diào)控，下面對近年來所發(fā)現(xiàn)的可能調(diào)控果實角質(zhì)層發(fā)育的植物激素進行簡要介紹。

4.2.1 脫落酸 水分脅迫會誘導(dǎo)植物體脫落酸的積累，而脫落酸信號則會激活一系列生理響應(yīng)，例

如促進蠟質(zhì)的積累來增強植物的持水能力以降低干旱條件對植物體的傷害[85]。而Martin 等[86]的研究表明脫落酸對番茄植株角質(zhì)層形成的調(diào)控作用不單單是干旱誘導(dǎo)的結(jié)果，同時也是與器官自然發(fā)育進程密切相關(guān)的，并不依賴于干旱脅迫的誘導(dǎo)，且發(fā)現(xiàn)脫落酸對番茄葉片的調(diào)控作用較果實而言更為顯著。近期，Romero 等[87]發(fā)現(xiàn)，ABA 可通過調(diào)控角質(zhì)層代謝基因的表達模式影響蠟質(zhì)代謝，ABA 缺乏會導(dǎo)致甜橙果實成熟過程中蠟質(zhì)組成發(fā)生改變，同時角質(zhì)層透性增加。然而，目前脫落酸對果實角質(zhì)層的具體調(diào)控機制還需要進一步闡明。

4.2.2 赤霉素 目前赤霉素廣泛應(yīng)用于預(yù)防由于角質(zhì)層破損或形成不當誘發(fā)的蘋果銹果病[88]。研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素處理可有效促進番茄果實和蘋果果實表面角質(zhì)層的沉積[88-89]，Li 等[90]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IS1 編碼一個GA2 氧化酶，該位點的突變將提高番茄果實的活性赤霉素含量，進而誘導(dǎo)提高了一系列角質(zhì)層形成相關(guān)基因的表達水平，從而促進番茄果實角質(zhì)和蠟質(zhì)的沉積，但目前赤霉素促進角質(zhì)層生物合成的具體機制尚不明確。

4.2.3 乙烯 乙烯是呼吸躍變型果實成熟進程中最重要的內(nèi)源植物激素之一，乙烯信號通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件傳導(dǎo)至細胞核區(qū)，最終啟動大量成熟相關(guān)基因的表達，促進果實成熟[91]。Kosma 等[92]發(fā)現(xiàn)乙烯合成受阻的 “ripening inhibitor（rin）”、“non-ripening（nor）”及一種延遲成熟的地方品種“Alcoba?a”3 種突變體番茄果實的角質(zhì)層組分尤其是蠟質(zhì)組分相較于“AC”番茄果實存在明顯差異，且這種差異貫穿于整個果實發(fā)育及成熟進程。Giménez 等[74，93]在番茄中利用RNAi 技術(shù)沉默TAGL1，番茄果實乙烯合成受阻，果實無法正常成熟，且沉默株系的果實角質(zhì)層發(fā)育異常。以上研究結(jié)果提示，果實角質(zhì)層的發(fā)育是果實成熟進程的一部分，而乙烯可能通過調(diào)控果實成熟相關(guān)基因控制果實成熟，進而調(diào)控果實角質(zhì)層的發(fā)育。然而目前尚未有研究直接證明乙烯和果實角質(zhì)層發(fā)育之間的相關(guān)性。

5 果實角質(zhì)層的研究方法

5.1 果實角質(zhì)層研究的材料選擇

在早年有關(guān)于角質(zhì)層的組成、結(jié)構(gòu)、生物合成與調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)大都是基于擬南芥模型，但是擬南芥的角質(zhì)層存在過薄、易碎、含有氣孔的特點，這并不利于角質(zhì)層的生物學(xué)研究[94]。而番茄果實的角質(zhì)層較厚、表面連續(xù)、不含氣孔、易于分離，且對番茄果實角質(zhì)層的研究將有助于推動理解角質(zhì)層對肉質(zhì)果實生理和品質(zhì)的作用機制，因此對于果實角質(zhì)層的研究來說，番茄是一種更加合適的模式植物[1，47]。

5.2 果實角質(zhì)層研究的試驗技術(shù)

5.2.1 果實角質(zhì)層的分離 果實角質(zhì)層的分離是研究果實角質(zhì)層的基礎(chǔ)。目前在果實角質(zhì)層分離上運用最廣泛的方法是酶分離法，通常利用不同濃度的酶解液獲得果實的角質(zhì)層，例如果膠酶和纖維素酶的混合酶解液。角質(zhì)層分離速度主要受到酶濃度、酶解溫度和酶解液pH 值的影響，提高酶濃度或溫度會加速角質(zhì)層的分離，而角質(zhì)層分離速度與酶解液pH 值呈負相關(guān)性[11]。此外，角質(zhì)和蠟質(zhì)的單獨分離技術(shù)也在不斷改良與創(chuàng)新，目前表面覆蓋蠟通常用黏合劑等機械方式剝離，嵌入蠟在表面覆蓋蠟剝離后用氯仿等有機溶劑浸提，而角質(zhì)的提取則在脫蠟果實的基礎(chǔ)上用酶解法結(jié)合有機溶劑萃取法分離[17，28，86]。

5.2.2 果實角質(zhì)層的分析 目前已趨于成熟的測試分析技術(shù)例如氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、氣液色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GLCMS）、甲苯胺藍染色法、蘇丹III 染色法、蘇丹IV染色法、金胺O 熒光染色法、光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）等都可用于角質(zhì)層組分的定性、定量分析和角質(zhì)層結(jié)構(gòu)勘測，而一些新興的高精度技術(shù)如二維GC、串聯(lián)色譜分析技術(shù)、高溫GC（HTGC）、高溫GC-MS 聯(lián)用技術(shù)（HTGC-MS）、紅外和Raman 顯微光譜分析將成為有價值的補充工具進而實現(xiàn)更精確的果實角質(zhì)層多樣性分析[3，74]。而目前成熟的各種分子生物學(xué)手段如RT-qPCR與各類高效率的生物技術(shù)服務(wù)則為闡明果實角質(zhì)層生物合成與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有力支持。此外，一系列計算機輔助技術(shù)也在果實角質(zhì)層的研究中發(fā)揮重要的作用。

5.3 果實角質(zhì)層的研究思路

果實角質(zhì)層中的角質(zhì)和蠟質(zhì)使得果實表面具有明顯的光澤。通過果實表皮亮度改變的表型來識別角質(zhì)層的突變體，以發(fā)現(xiàn)調(diào)控果實角質(zhì)層形成的候選基因[95]。

利用組學(xué)技術(shù)對果實角質(zhì)層發(fā)生改變的突變體與野生型進行全面分析與比較，找到控制突變的候選關(guān)鍵基因及相關(guān)代謝途徑[3]。目前大量研究結(jié)果提示果實角質(zhì)層的形成是果實成熟進程中的一部分，因此，可以嘗試通過一些基因工程技術(shù)例如病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)篩選出一些能夠調(diào)控果實角質(zhì)層形成的成熟相關(guān)基因，可能的思路如下：

（1）角質(zhì)層的組學(xué)分析，包括利用轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白組篩選可能參與果實角質(zhì)層形成的候選基因；（2）通過VIGS 技術(shù)高通量篩選候選基因；（3）通過果實貯藏失水和表皮細胞結(jié)構(gòu)觀察等試驗分析角質(zhì)層變化；（4）確定候選基因在果實角質(zhì)層形成網(wǎng)絡(luò)中的作用。

對擬南芥中已報道的角質(zhì)層代謝相關(guān)基因和番茄果實中已鑒定出的角質(zhì)層數(shù)量性狀位點[96]進行轉(zhuǎn)基因功能驗證，通過CRISPR/Cas9、RNAi、過表達等轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得該基因位點的突變體，并對突變體果實的角質(zhì)層組成、結(jié)構(gòu)，表皮代謝模式進行系統(tǒng)分析，以解析該基因在果實角質(zhì)層形成中的功能。

6 展望

果實是植物體上極具食用價值和經(jīng)濟價值的繁殖器官，角質(zhì)層對于保護果實的生長發(fā)育和維持其采后貯藏品質(zhì)具有重要的作用，然而目前對于角質(zhì)層的研究主要還是集中在擬南芥和番茄等模式植物的葉片等營養(yǎng)器官上，對非模式植物及果實角質(zhì)層的研究尚不充分。

果實角質(zhì)層復(fù)雜的生物合成和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至今尚不完全清晰，其中涉及的相關(guān)分子機制應(yīng)是今后研究需要重點關(guān)注的領(lǐng)域。目前大量研究提示角質(zhì)層的形成是果實成熟進程的一部分，因此控制果實成熟的相關(guān)基因有望成為接下來果實角質(zhì)層生物合成與調(diào)控分子機制的研究方向。

當前研究發(fā)現(xiàn)果實角質(zhì)層組分、結(jié)構(gòu)、特性在采后的變化對于果實的采后貯藏性能具有顯著的影響，因此明確重要經(jīng)濟作物果實角質(zhì)層的采后變化規(guī)律對于指導(dǎo)果實采后處理，更好地維持其采后貯藏品質(zhì)具有重要的意義。

近年來對于果實角質(zhì)層的組分、結(jié)構(gòu)、功能特性及生物合成與調(diào)控的研究雖然取得了長足的進步，但其中還是存在很大的知識空缺，在深入研究的同時應(yīng)該與果蔬產(chǎn)業(yè)鏈的各個環(huán)節(jié)相結(jié)合，并進一步轉(zhuǎn)化為食用健康價值和社會經(jīng)濟價值。