死亡相關(guān)蛋白激酶1、KLF4、6-氧-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化狀態(tài)檢測(cè)及與宮頸癌人乳頭瘤病毒16感染的關(guān)系

倪 茗, 劉婷婷, 汪 俊, 鄒學(xué)紅, 周紅玉, 王 燕, 余桂梅

(1. 武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院 婦科, 湖北 武漢, 430050;2. 湖北省婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 湖北 武漢, 430070)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，隨著宮頸癌篩查技術(shù)及疫苗水平不斷提高，宮頸癌得以較好預(yù)防與治療，但其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明[1]。研究[2]顯示，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)長(zhǎng)期感染是宮頸病變的重要因素，其中HPV-16較為常見，但僅有20% 的HPV-16感染者會(huì)最終發(fā)展為宮頸癌，推測(cè)HPV感染需與其他因素協(xié)同作用促進(jìn)宮頸癌發(fā)展。研究[3]顯示，個(gè)體對(duì)環(huán)境暴露因素的遺傳易感性在宮頸癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

近年來(lái)，基因甲基化引起的抑癌基因表達(dá)下調(diào)與宮頸癌的關(guān)系已成為研究重點(diǎn)。死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)是γ干擾素介導(dǎo)的凋亡正性調(diào)節(jié)因子，是一種與多種細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路聯(lián)系的抑癌基因[4]。研究[5]顯示,DAPK1甲基化水平與宮頸癌的疾病進(jìn)展有關(guān)，參與宮頸癌的發(fā)生。轉(zhuǎn)錄因子KLF4在腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌基因功能[6-7]。婁雪玲等[8]研究顯示，宮頸癌患者癌組織中KLF4表達(dá)顯著低于子宮頸炎患者。6氧-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是宮頸癌的抑癌基因[9]。檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能有助于宮頸癌的早期診斷和篩查[10]?；贖PV-16感染在宮頸癌中的重要作用，本研究分別對(duì)慢性子宮頸及宮頸癌患者宮頸脫落組織DAPK1、KLF4、MGMT甲基化及HPV感染狀態(tài)進(jìn)行比較，并探討DAPK1、KLF4、MGMT甲基化與HPV感染狀態(tài)相關(guān)性，為宮頸癌變的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月—2021年6月武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院初治宮頸癌患者103例作為研究對(duì)象(宮頸癌組)。年齡27～74歲，平均(50.38±5.12)歲; Ⅰ期16例, Ⅱ期18例, Ⅲ期31例，Ⅳ期38例; 高分化31例，中分化51例，低分化21例; 鱗癌31例，腺癌57例，腺鱗癌15例。納入標(biāo)準(zhǔn): 經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、病理組織切片確診為宮頸癌者; 患者均接受手術(shù)切除治療，且治療前未經(jīng)化放療; 患者臨床病理資料完備。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并其他惡性腫瘤者; 合并自身免疫疾病者; 患者處于急性感染期; 合并臟器功能不全者。另選取同期因慢性子宮頸炎進(jìn)行宮頸篩查的體檢者110例作為對(duì)照組，年齡26～73歲，平均(51.62±5.48)歲。研究對(duì)象均簽署知情同意書。2組研究對(duì)象在年齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化狀態(tài)檢測(cè): 采用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)標(biāo)本收集細(xì)胞采集標(biāo)本。按照Z(yǔ)R Genomic DNA II KitTM試劑盒說(shuō)明書提取組織DNA, 通過(guò) EZ DNA Methylation GoldTM Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行基因甲基化修飾后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR), 上、下游引物序列見表1。反應(yīng)體系為10×buffer 2.0 μL, MgCl21.5 μL, dNTP 1.5 μL, 樣本4.0 μL, 上、下游引物各1.0 μL, ddH2O 8.25 μL, Taq酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)熱10 min, 95 ℃, 57 ℃, 72 ℃循環(huán)40次, 72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存，行瓊脂糖凝膠電泳并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 HPV16感染檢測(cè): 收集研究對(duì)象脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本，通過(guò)原位雜交法[11]檢測(cè)研究對(duì)象HPV16感染情況。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，采用檢驗(yàn); 采用Spearman相關(guān)分析，分析HPV16感染與DAPK1、KLF4、MGMT基因異常甲基化間的相關(guān)關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè)),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV16感染檢測(cè)情況

與對(duì)照組相比，宮頸癌組患者HPV16感染陽(yáng)性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 對(duì)照組與宮頸癌組患者HPV感染情況比較

2.2 宮頸癌組與對(duì)照組DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化情況

與對(duì)照組相比，宮頸癌組DAPK1、KLF4、MGMT基因異常甲基化率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化(M)與未甲基化(U)電泳結(jié)果

表3 對(duì)照組與宮頸癌組DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化情況比較[n(%)]

2.3 宮頸癌組織中DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化狀態(tài)與臨床病理學(xué)特征關(guān)系

根據(jù)DAPK1甲基化狀態(tài)將患者分為DAPK1甲基化組47例,DAPK1非甲基化組56例; 根據(jù)KLF4甲基化狀態(tài)分為KLF4甲基化組53例,KLF4非甲基化組50例; 根據(jù)MGMT甲基化狀態(tài)分為MGMT甲基化組31例,MGMT非甲基化組72例; 觀察APK1、KLF4、MGMT甲基化狀態(tài)與宮頸癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系。分化程度低、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者宮頸癌組織甲基化率高于分化程度高、中以及TNM分期Ⅰ～Ⅱ、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 在不同年齡、宮頸癌類型、腫瘤大小患者中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征關(guān)系[n(%)]

2.4 宮頸癌組APK1、KLF4、MGMT甲基化與HPV16感染相關(guān)性

與HPV16感染陰性相比, HPV16感染陽(yáng)性患者中APK1、KLF4、MGMT甲基化比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表5。HPV16感染情況與APK1、KLF4、MGMT甲基化呈正相關(guān)(r=0.454, 0.307,P<0.05)。

表5 宮頸癌組織APK1、KLF4、MGMT甲基化與HPV16感染相關(guān)性[n(%)]

3 討 論

高危HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的重要原因，其中以HPV16為最常見類型，但部分感染HPV16患者可轉(zhuǎn)陰，宮頸癌的發(fā)病是多種原因共同促進(jìn)發(fā)展的結(jié)果。

DAPK1定位于9q34.1, 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與多種途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。石雪等[12]研究顯示,DAPK1基因CpG島甲基化是DAPK表達(dá)缺失的重要原因。TAN Y L等[13]研究顯示，宮頸癌患者宮頸組織DAPK1高甲基化。本研究中，宮頸癌組織中DAPK1基因甲基化率為45.6%, 顯著高于慢性子宮頸炎患者的22.7%, 提示DAPK1基因甲基化與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，分化程度低、TNM分期 Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者宮頸癌組織DAPK1基因甲基化率顯著高于分化程度高、中以及TNM分期Ⅰ～Ⅱ、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，提示DAPK1基因甲基化與宮頸癌的發(fā)展緊密相關(guān)，而在年齡、宮頸癌類型、腫瘤大小方面比較差異不顯著。本研究發(fā)現(xiàn),DAPK1甲基化宮頸癌組織中HPV16陽(yáng)性率為72.3%, 而DAPK1未甲基化宮頸癌組織中HPV16陽(yáng)性率僅為26.8%, 提示DAPK1甲基化與HPV16感染密切相關(guān)。

KLF4可在不同腫瘤類型中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，存在組織差異，其在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮癌基因作用[7], 而在胃癌、肝癌等上皮癌中發(fā)揮抑癌作用[14-15]。研究[16]顯示,KLF4基因在宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展中作為腫瘤抑制因子失活，且DNA甲基化與KLF4蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，去甲基化劑5-Aza處理宮頸癌SiHa和C33A細(xì)胞, KLF4蛋白表達(dá)恢復(fù)。本研究中，宮頸癌組患者癌組織KLF4甲基化率顯著高于慢性子宮頸炎患者，提示KLF4甲基化與宮頸癌的發(fā)生有關(guān); 與病理學(xué)關(guān)系研究顯示,KLF4甲基化與宮頸癌患者分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，而與腫瘤大小、腫瘤類型、年齡無(wú)關(guān)，提示KLF4甲基化在宮頸癌病情及預(yù)后中有一定價(jià)值。本研究中,KLF4甲基化與HPV16感染呈正相關(guān)，提示HPV16感染可能通過(guò)影響KLF4甲基化參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。猜測(cè)KLF4基因甲基化可作為宮頸癌基因?qū)哟蔚臉?biāo)志物，在宮頸癌診斷、病情及預(yù)后中發(fā)揮作用。

MGMT基因編碼DNA修復(fù)蛋白，能夠保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷[17]。在宮頸癌中,MGMT基因沉默, HPV16病毒大量翻譯，細(xì)胞傾向癌變。本研究中,MGMT基因甲基化率高于慢性子宮頸炎者，提示MGMT基因甲基化與宮頸癌患者的發(fā)病有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),MGMT基因甲基化與宮頸癌患者分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，提示MGMT基因甲基化與宮頸癌的發(fā)展關(guān)系密切，猜測(cè)MGMT基因甲基化可能能作為宮頸癌檢測(cè)的標(biāo)志物，但本研究未做研究，有待進(jìn)一步探討。研究[18]顯示,MGMT表達(dá)下調(diào)可增加患者高危HPV感染概率。本研究中,MGMT基因甲基化與患者HPV16感染呈正相關(guān)，提示MGMT基因甲基化與HPV16感染相關(guān)。

綜上所述, HPV16感染可能與APK1、KLF4、MGMT甲基化密切相關(guān), HPV16感染可能與APK1、KLF4、MGMT協(xié)同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究仍存在一定的不足，宮頸癌發(fā)病緩慢、機(jī)制復(fù)雜，是多種因素長(zhǎng)期累積結(jié)果，鑒于DNA甲基化與宮頸癌變關(guān)系的復(fù)雜性，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。