微小RNA-106通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路影響子宮內(nèi)膜癌RL95-2細胞生物學行為的研究

邵 洋, 姚 超, 徐崧圓, 強 萍

(江蘇省張家港市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 張家港, 215600)

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較強的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，其發(fā)病率逐年升高并呈年輕化的趨勢，患者5年相對存活率約為82%, 但晚期患者易發(fā)生復發(fā)及轉(zhuǎn)移，治療效果仍不理想，其發(fā)病機制也不明確，因此研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要的意義[1-2]。微小RNA-106(miR-106)是研究較多的miRNA, 在宮頸癌[3]、胃癌[4]、肝癌[5]等腫瘤中表達上調(diào)，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖與遷移等。研究[6]顯示, miR-106在子宮內(nèi)膜癌組織與細胞系中高表達，可促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖與侵襲，但miR-106對子宮內(nèi)膜癌影響的具體作用機制尚不清楚。PTEN是一種抑癌基因，可負向調(diào)節(jié)AKT信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖與遷移，且PTEN/PI3K/AKT通路參與調(diào)控多種腫瘤細胞遷移與侵襲[7]。研究[8]顯示, PTEN在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達，與子宮內(nèi)膜癌病理分級、浸潤程度有關(guān)。目前, miR-106對PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響尚不清楚。本研究在子宮內(nèi)膜癌細胞(RL95-2細胞)中抑制miR-106表達，觀察miR-106對RL95-2細胞增殖、遷移及侵襲的影響及其對PTEN/PI3K/AKT通路的調(diào)控作用，初步探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2購自中國科學院細胞庫; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司，抑制miR-106表達質(zhì)粒(miR-106 inhibitor)及其陰性對照(NC inhibitor)、PTEN過表達質(zhì)粒(PTEN)及其陰性對照(pcDNA)、miR-106過表達質(zhì)粒(miR-106 mimics)及其陰性對照(miR-NC)購自上海Genepharma公司; TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司; miR-106、PTEN、U6、β-action引物購自廣州銳博生物科技有限公司; 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技公司; 兔抗人PTEN、p-PI3K、p-AKT單克隆抗體購自英國Abcam公司。

選擇2019年6月—2021年6月行手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織標本及癌旁組織(距離腫瘤組織≥0.5 cm的正常組織)23例，年齡34～73歲，平均(57.60±9.80)歲; 患者術(shù)前未經(jīng)任何抗腫瘤治療，術(shù)后經(jīng)病理診斷為子宮內(nèi)膜樣腺癌20例，漿液性腺癌3例; 根據(jù)FIGO分期，臨床分期為Ⅰ期18例, Ⅱ期5例。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測子宮內(nèi)膜癌組織標本及癌旁組織中miR-106表達。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染: RL95-2細胞采用含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng); 待細胞生長至對數(shù)期時，將RL95-2細胞密度調(diào)整為1×105個/mL, 接種于6孔板中; 培養(yǎng)24 h后，分別轉(zhuǎn)染miR-106 inhibitor、NC inhibitor、PTEN、pcDNA、PTEN+miR-NC及PTEN+miR-106 mimics共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(依次作為miR-106 inhibitor組、NC inhibitor組、PTEN組、pcDNA組、PTEN+miR-NC組及PTEN+miR-106組)，轉(zhuǎn)染方法參考Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書; 轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h, 另設(shè)對照組(不做轉(zhuǎn)染)。qRT-PCR檢測細胞中miR-106與PTENmRNA表達，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒? 根據(jù)生物信息學軟件starbase預測顯示, miR-106與PTEN存在靶向關(guān)系，根據(jù)miR-106與PTEN 3′UTR結(jié)合區(qū)域，分別構(gòu)建野生型PTEN-3′UTR-WT和突變型PTEN-3′UTR-MUT質(zhì)粒，均與miR-106 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染RL95-2細胞，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.3 miR-106、PTENmRNA水平檢測: TRIzol試劑提取總RNA，采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-106、PTENmRNA相對表達量，分別以U6和β-action為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-106、PTENmRNA相對表達量。miR-106: 上游引物(5′-3′)為AAGTGCTGACAGTGCAG, 下游引物(5′-3′)為GAACATGTCTGCGTATCTC。U6: 上游引物(5′-3′)為GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物(5′-3′)為CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。PTEN: 上游引物(5′-3′)為TGAGTTCCCTCAGCCGTTACCT, 下游引物(5′-3′)為GAGGTTTCCTCTGGTCCTGGTA。β-action: 上游引物(5′-3′)為GACCTCTATGCCAACACAGT, 下游引物(5′-3′)為AGTACTTGCGCTCAGGAGGA。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖: 轉(zhuǎn)染后的對數(shù)期RL95-2細胞，采用胰酶消化后調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL, 接種至96孔板中，常規(guī)條件下培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，孵育3 h后，檢測酶標儀450 nm處的光密度(OD450 nm)值，繪制細胞生長曲線。

1.2.5 Transwell小室檢測細胞遷移與侵襲: ① 細胞遷移實驗。使用無血清培養(yǎng)基將RL95-2細胞制備成2×105個/mL的細胞懸液, Transwell上室中接種200 μL細胞懸液，下室接種600 μL完全培養(yǎng)基，常規(guī)條件培養(yǎng)24 h后，拭去未穿膜細胞, 4%多聚甲醛固定15 min, 0.5%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機選擇6個視野觀察遷移細胞數(shù)。② 細胞侵襲實驗。Transwell小室上室鋪無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待膠凝固后，加入細胞懸液，其余步驟同細胞遷移實驗。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡: 將各組對數(shù)生長期RL95-2細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入結(jié)合緩沖液混勻，再加入5 μL的Annexin V-FITC, 避光孵育20 min，上機前加入5 μL的PI溶液染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(WB)檢測細胞中PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表達: 提取細胞總蛋白后，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜, 5%牛血清白蛋白封閉2 h, 加入PTEN、p-PI3K、p-AKT單克隆抗體和β-actin抗體(1∶1 500), 4 ℃孵育過夜, PBST洗滌膜3次，加二抗室溫孵育2 h, ECL溶液顯色，以β-actin為內(nèi)參，Quantity One軟件分析目的條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織miR-106表達

子宮內(nèi)膜癌組織中miR-106表達水平為(3.53±0.42), 高于癌旁組織的(1.01±0.11), 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細胞miR-106及PTEN mRNA的表達

與NC inhibitor組比較, miR-106 inhibitor組細胞miR-106表達水平降低,PTENmRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與pcDNA組比較, PTEN組細胞miR-106表達水平降低,PTENmRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與PTEN+miR-NC組比較, PTEN+miR-106組細胞miR-106表達水平升高,PTENmRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細胞miR-106表達

2.3 抑制miR-106表達對RL95-2細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

NC inhibitor組與對照組RL95-2細胞的OD450 nm值、細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)及凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); miR-106 inhibitor組RL95-2細胞OD450 nm值、細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)低于NC inhibitor組，細胞凋亡率高于NC inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 上述結(jié)果表明抑制miR-106表達可顯著抑制RL95-2細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，見圖1、表2。

A: 各組RL95-2細胞增殖情況,與NC inhibitor組比較, *P<0.05; B: Transwell小室檢測各組RL95-2細胞遷移與侵襲(放大倍數(shù)400倍); C: 流式細胞儀檢測各組RL95-2細胞凋亡。圖1 抑制miR-106表達對RL95-2細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

表2 抑制miR-106表達對RL95-2細胞遷移、侵襲及凋亡的影響

2.4 miR-106與PTEN靶向調(diào)控關(guān)系

經(jīng)starbase數(shù)據(jù)庫預測顯示, miR-106與PTENmRNA 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果顯示，過表達miR-106后, PTEN-3′UTR-WT的相對熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); miR-106 mimics與PTEN-3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染后，相對熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 證明miR-106與PTEN存在靶向關(guān)系。見圖2。

A: miR-106與PTEN mRNA結(jié)合位點預測; B: 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果,與miR-NC比較, *P<0.05。圖2 miR-106與PTEN靶向調(diào)控關(guān)系

2.5 抑制miR-106表達對PTEN/PI3K/AKT通路蛋白的影響

WB結(jié)果顯示, NC inhibitor組與對照組細胞PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); miR-106 inhibitor組RL95-2細胞PTEN蛋白表達水平高于NC inhibitor組, p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平低于NC inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 抑制miR-106表達對PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表達的影響

表3 抑制miR-106表達對PTEN/PI3K/AKT通路蛋白的影響

2.6 miR-106通過PTEN/PI3K/AKT通路影響RL95-2細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡

為驗證miR-106通過PTEN/PI3K/AKT通路對RL95-2細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的調(diào)控作用，在RL95-2細胞中過表達PTEN, 結(jié)果顯示，與pcDNA組比較，過表達PTEN可降低p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平，抑制細胞增殖、遷移與侵襲能力，促進細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 在RL95-2細胞中同時過表達PTEN與miR-106，結(jié)果顯示，與PTEN+miR-NC組比較, PTEN+miR-106組RL95-2細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平升高，細胞增殖、遷移與侵襲能力升高，細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表4。

3 討 論

研究[9]顯示, miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色, miRNAs可通過調(diào)控靶基因的表達以及影響細胞增殖、遷移與侵襲等參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。研究[10-11]顯示，多種miRNAs如miR-652、miR-34b與子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、遷移、化療敏感性有關(guān)，但還有部分miRNAs的作用尚不清楚。miR-106是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的一種miRNA，研究[12-13]表明, miR-106在結(jié)腸癌、胃癌、鼻咽癌等多種腫瘤中異常表達，發(fā)揮促癌基因的作用。研究[14]表明, miR-106b在子宮內(nèi)膜癌組織中上調(diào)表達，與腫瘤組織分化、患者預后及細胞增殖、遷移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示, miR-106在子宮內(nèi)膜癌組織中表達水平高于癌旁組織癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。張成偉等[15]研究表明, miR-106a-5p可靶向調(diào)控重組人轉(zhuǎn)化生長因子B受體-2(TGF-BR2)促進肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究在RL95-2細胞中抑制miR-106的表達，結(jié)果顯示, miR-106 inhibitor組RL95-2細胞OD450 nm值、細胞遷移和侵襲數(shù)顯著低于NC inhibitor組，細胞凋亡率顯著高于NC inhibitor組，表明抑制miR-106表達能顯著抑制RL95-2細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡, miR-106可能在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮促癌作用，但其具體調(diào)控機制尚不清楚。

A: 各組RL95-2細胞增殖曲線,與pcDNA組比較, *P<0.05, 與PTEN+miR-NC組比較, #P<0.05; B: 各組RL95-2細胞遷移與侵襲圖(放大倍數(shù)400倍); C: 各組RL95-2細胞凋亡圖; D: 各組RL95-2細胞PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表達電泳圖。圖4 miR-106通過PTEN/PI3K/AKT通路對RL95-2細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

表4 miR-106通過PTEN/PI3K/AKT通路影響RL95-2細胞遷移、侵襲及凋亡

本研究經(jīng)starbase數(shù)據(jù)庫預測顯示, miR-106與PTENmRNA 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示, miR-106與PTEN存在靶向負調(diào)控關(guān)系。PTEN是一種抑癌基因，可將磷脂酰肌醇-3, 4, 5-三磷酸(PIP3)轉(zhuǎn)化為二磷酸產(chǎn)物(PIP2), 使PI3K去磷酸化，抑制PI3K/AKT信號通路的活化，抑制腫瘤進展，如調(diào)控細胞生長、凋亡、黏附、遷移和侵襲[16-17]。研究[18]顯示, PTEN在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達，激活PI3K/AKT信號通路可促進腫瘤細胞增殖。李玉蘭等[19]研究表明, miR-144-3p可靶向調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路以促進口腔鱗癌CAL27細胞增殖、侵襲并抑制細胞凋亡。研究[20]顯示, miR-374b可抑制PTEN的表達，激活PI3K/AKT通路，促進肺癌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-106表達后, RL95-2細胞PTENmRNA 及其蛋白表達水平顯著升高, p-PI3K、p-AKT水平顯著降低，表明miR-106可靶向負調(diào)控PTEN表達，進而調(diào)控PI3K/AKT通路，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。本研究在過表達PTEN基礎(chǔ)上過表達miR-106后發(fā)現(xiàn), RL95-2細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著升高，細胞增殖、遷移與侵襲能力顯著增強，細胞凋亡率顯著降低，提示miR-106可通過靶向抑制PTEN表達來激活PI3K/AKT通路以促進RL95-2細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。

綜上所述, miR-106可通過靶向抑制PTEN表達并激活PI3K/AKT通路來促進人子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、遷移及侵襲，抑制細胞凋亡。鑒于PTEN/PI3K/AKT通路還涉及多個分子參與，其具體調(diào)控機制仍需進一步的研究。