皮膚惡性黑色素瘤組織中微小RNA-185-5p、SOX13的表達及臨床意義

陳 華, 嚴(yán) 旭, 宋樹玲

(1. 山東省棗莊市皮膚病性病防治院 皮膚科, 山東 滕州, 277500;2. 山東省滕州市中心人民醫(yī)院 皮膚科, 山東 滕州, 277500;3. 山東省棗莊市立醫(yī)院 皮膚科, 山東 棗莊, 277000)

皮膚惡性黑色素瘤(CMM)為皮膚科常見惡性腫瘤，其起病隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，病死率高，預(yù)后較差[1], CMM的發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的5%左右，在皮膚惡性腫瘤中病死率最高[2], 臨床常用手術(shù)、放化療等方式治療，但很難徹底治愈，目前關(guān)于CMM的發(fā)病機制尚不十分清楚，因此，研究CMM的發(fā)病機制對CMM的治療具有重要意義。微小RNA(miRNA)為非編碼小分子RNA, 參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，并與多種疾病如惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3]。miR-185-5p為常見的一種微小RNA, 在多種腫瘤中表達下調(diào)，上調(diào)腫瘤細(xì)胞中miR-185-5p表達可顯著抑制腫瘤的增殖[4]。研究[5]顯示，過表達miR-185-5p可靶向調(diào)控MAPK14, 阻斷細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制黑色素瘤A375細(xì)胞的侵襲、遷移和腫瘤形成。SOX13屬于SOX基因家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。研究[6]表明，結(jié)直腸癌組織中SOX13的表達明顯上調(diào)，因此阻斷SOX13表達可抑制結(jié)直腸癌的遷移、侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究檢測CMM組織中miR-185-5p與SOX13的表達情況，初步探討miR-185-5p、SOX13與CMM發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2018年4月行手術(shù)治療的61例CMM患者為觀察對象，取所選患者的CMM組織標(biāo)本(CMM組)。61例CMM患者中，男38例，女23例; 年齡31～80歲，平均(59.70±11.40)歲; 腫瘤直徑<2 cm者27例, ≥2 cm者34例; 發(fā)病部位為頭頸部26例，軀干部12例，四肢23例; 腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期者29例, Ⅲ～Ⅳ期者32例; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)病理學(xué)檢查確診為CMM者; ② 術(shù)前未經(jīng)藥物、激光、放射治療者; ③ 患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并糖尿病、高血壓等嚴(yán)重慢性疾病者; ② 合并其他惡性腫瘤者。另外，選取同時期61例診斷為皮膚良性色素痣的健康人群的組織標(biāo)本為對照組，其中男40例，女21例，年齡32～78歲，平均(59.50±11.50)歲，發(fā)病部位為四肢者29例，非肢端32例。研究樣本采集均經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。CMM組與對照組標(biāo)本供者的性別、年齡、發(fā)病部位等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑

miR-185-5p、SOX13及內(nèi)參基因GAPDH、U6的引物由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計與合成, miRNeasy Mini Kit購自Qiagen公司, TaqmanmicroRNA reverse Transcription Kit購自Thermo Fisher公司, SYBR Green qPCR Mix、免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人SOX13多克隆抗體購自Elabscience公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測CMM組織與色素痣組織中SOX13、miR-185-5p的表達: 手術(shù)取患者CMM組織及色素痣組織標(biāo)本, -80 ℃冰箱凍存。取冷凍標(biāo)本，采用qRT-PCR檢測miR-185-5p、SOX13mRNA的表達，引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△CT分析法計算miR-185-5p、SOX13mRNA的相對表達量，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。

表1 qRT-PCR檢測的引物序列

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色: 將手術(shù)過程中取得的標(biāo)本進行石蠟包埋，連續(xù)切片后，經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)和封閉，之后加入兔抗人SOX13多克隆抗體(按照1∶500稀釋), 4 ℃冰箱孵育過夜后，加入二抗(按照1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h, DAB染色，蘇木素復(fù)染，采用顯微鏡觀察。染色結(jié)果判斷: SOX13陽性表現(xiàn)為黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞核，根據(jù)陽性細(xì)胞占比進行評分, 0～10%、>10%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別判為0、1、2、3、4分。根據(jù)細(xì)胞著色深度進行評分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將2項評分相乘，總分≤1分判為陰性(-)，總分≥2分為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析, miR-185-5p、SOX13mRNA表達水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗; 計數(shù)資料采用[n(%)]表示，組間比較采用卡方檢驗; Pearson法分析CMM組織中miR-185-5p與SOX13mRNA表達水平的相關(guān)性; Kaplan-Meier生存曲線分析miR-185-5p、SOX13表達與CMM患者生存率的關(guān)系; Cox回歸模型分析CMM患者的預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CMM組織與色素痣組織中miR-185-5p及SOX13 mRNA表達水平比較

CMM組織中, miR-185-5p表達水平為(0.47±0.08), 低于色素痣組織的(1.01±0.13), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=27.630,P<0.05); CMM組織中SOX13mRNA表達水平為(2.32±0.51), 高于色素痣組織的(1.05±0.11), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.012,P<0.05)。

2.2 CMM組織與色素痣組織SOX13蛋白表達水平比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, CMM組織中SOX13蛋白陽性表達率為59.02%, 色素痣組織中SOX13蛋白陽性表達率為13.11%。CMM組織中SOX13蛋白陽性表達率高于色素痣組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖1、表2。

A: 色素痣組織中SOX13陰性表達; B: CMM組織中SOX13陽性表達。

2.3 CMM組織中miR-185-5p與SOX13 mRNA的相關(guān)性

表2 SOX13蛋白在CMM組織與色素痣組織中的表達

Pearson相關(guān)性分析顯示, CMM組織中miR-185-5p與SOX13mRNA表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635,P<0.05), 見圖2。生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn), miR-185-5p與SOX13存在靶向結(jié)合位點，見圖3。

圖2 CMM組織中miR-185-5p與SOX13 mRNA的相關(guān)性

圖3 生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測miR-185-5p與SOX13的靶向結(jié)合位點

2.4 miR-185-5p、SOX13與CMM臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)miR-185-5p在CMM組織中表達水平，將CMM患者分為miR-185-5p高表達組(miR-185-5p表達水平≥0.47)31例和miR-185-5p低表達組(miR-185-5p表達水平<0.47)30例。根據(jù)SOX13蛋白在CMM組織中的表達結(jié)果，將CMM患者分為SOX13陽性表達組36例和SOX13陰性表達組25例。結(jié)果發(fā)現(xiàn), miR-185-5p、SOX13表達與浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05), 與患者性別、年齡、腫瘤直徑、發(fā)病部位和腫瘤分期無關(guān)(P>0.05), 見表3。

表3 miR-185-5p、SOX13與CMM臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.5 Kaplan-Meier生存分析

對所有患者隨訪36個月, Kaplan-Meier生存曲線分析顯示, miR-185-5p高表達組3年生存率為65.55%, miR-185-5p低表達組3年生存率為37.78%, miR-185-5p高表達組3年生存率高于miR-185-5p低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.871,P=0.015); SOX13陽性表達組的3年生存率為38.12%, SOX13陰性表達組3年生存率為65.87%, SOX13陽性表達組3年生存率低于SOX13陰性表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.030,P=0.020), 見圖4。

A: miR-185-5p高表達和miR-185-5p低表達患者累計生存曲線; B: SOX13陰性表達和SOX13陽性表達患者累計生存曲線。

2.6 CMM患者預(yù)后影響因素分析

單因素和多因素Cox分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SOX13是CMM患者不良預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05), miR-185-5p是CMM患者不良預(yù)后的保護因素(P<0.05), 見表4。

表4 影響CMM患者預(yù)后的單因素和多因素Cox分析結(jié)果

3 討 論

miR-185-5p定位于染色體q11.21, 在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、腫瘤耐藥性等過程中發(fā)揮重要作用[7]。多項研究[8-10]顯示, miR-185-5p在胰腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中低表達。CHEN X G等[11]研究表明，長鏈非編碼RNA UCA1通過靶向miR-185-5p的表達調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，抑制黑色素瘤的生長與侵襲。YIN C G等[12]研究表明, miR-185-5p在乳腺癌組織與細(xì)胞中呈低表達，與腫瘤直徑、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān), miR-185-5p可通過調(diào)節(jié)晚期糖基化終產(chǎn)物特異性受體抑制F-actin聚合并逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究檢測了miR-185-5p在CMM組織中表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn), CMM組織中miR-185-5p表達水平低于色素痣組織，提示miR-185-5p可能與CMM的發(fā)生有關(guān)，其機制可能與miR-185-5p參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。進一步分析顯示, miR-185-5p表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、發(fā)病部位和腫瘤分期無關(guān)，與浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-185-5p可能參與CMM的發(fā)生與進展過程。

SOX家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控胚胎發(fā)育與細(xì)胞生理功能。研究[13]報道,SOX基因家族成員，如SOX2、SOX4與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。SOX13是SOX家族成員之一，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、糖尿病及膽汁性肝硬化等生理病理過程[14]。SOX13的異常表達還與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其可促進胰腺癌的侵襲與進展[15]。SOX13在肝癌中表達上調(diào)，與肝癌患者的不良預(yù)后有關(guān), SOX13參與維持肝癌細(xì)胞的癌干樣特性，并在肝癌的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16];SOX13在人胃癌組織中的表達上調(diào)，與患者預(yù)后相關(guān)，且SOX13的表達上調(diào)可顯著促進胃癌細(xì)胞的增殖[17]。本研究結(jié)果顯示, CMM組織中SOX13mRNA表達水平及蛋白陽性表達率高于色素痣組織，且與CMM的浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SOX13可能在CMM發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。

本研究還發(fā)現(xiàn), CMM組織中miR-185-5p表達水平與SOX13mRNA表達呈負(fù)相關(guān)，且生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn), miR-185-5p與SOX13存在靶向結(jié)合位點，提示miR-185-5p與SOX13可能通過靶向調(diào)控關(guān)系參與CMM的發(fā)生、發(fā)展。本研究的Kaplan-Meier生存曲線分析可知, miR-185-5p高表達患者3年生存率高于miR-185-5p低表達患者, SOX13陽性表達患者3年生存率低于SOX13陰性表達患者，提示miR-185-5p、SOX13與CMM患者預(yù)后相關(guān)。Cox回歸模型分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SOX13是CMM患者不良預(yù)后的獨立危險因素, miR-185-5p是CMM患者不良預(yù)后的保護因素，進一步提示miR-185-5p、SOX13可能作為評估CMM患者預(yù)后不良的標(biāo)志物。

綜上所述, CMM組織中miR-185-5p呈低表達, SOX13呈高表達，且均與CMM患者臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)，可能作為CMM潛在的預(yù)后標(biāo)志物，但兩者的具體作用機制需要結(jié)合細(xì)胞模型或動物模型進行進一步研究。