可切除肝細(xì)胞癌患者癌旁肝組織中分泌型簇集蛋白的表達(dá)與術(shù)后生存預(yù)后的相關(guān)性

黃 蓉, 樊 斌, 丁 俊

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 肝膽胰脾外科, 湖北 恩施, 445000)

肝細(xì)胞癌(HCC)占所有肝癌病例的70%～85%, 是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。目前，手術(shù)切除仍是治愈HCC的主要手段，但約80%的HCC患者在根治性切除術(shù)后仍會(huì)發(fā)生肝內(nèi)復(fù)發(fā), 5年病死率超過(guò)50%[2]。原發(fā)性HCC復(fù)發(fā)包括肝內(nèi)復(fù)發(fā)和多中心復(fù)發(fā)，肝內(nèi)復(fù)發(fā)主要與腫瘤因素有關(guān)，而多中心復(fù)發(fā)還可能與其他肝臟背景因素有關(guān)[3-4]。因此，僅關(guān)注腫瘤組織是不夠的，癌旁組織有關(guān)分子學(xué)改變也可能會(huì)直接或間接影響手術(shù)后疾病進(jìn)展。簇集蛋白(CLU)是最初從大鼠睪丸中分離出的一種高度保守的糖蛋白，在人體所有組織中都有表達(dá)[5]。事實(shí)上,CLU基因可編碼分泌型sCLU蛋白(sCLU)和核sCLU蛋白(nCLU), 而sCLU和nCLU蛋白在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)病理生理過(guò)程中可能發(fā)揮著相反的作用[6-7]。多項(xiàng)研究[6-9]證實(shí)了sCLU在各種惡性腫瘤中的預(yù)后價(jià)值，但結(jié)果卻相互矛盾。本研究調(diào)查sCLU在可切除HCC患者癌旁肝組織和血清中的表達(dá)水平及預(yù)后評(píng)估作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究是在獲得本院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)并在赫爾辛基宣言指導(dǎo)原則下進(jìn)行的?；颊咴跇颖精@取前簽署了知情同意書(shū)，所有患者數(shù)據(jù)都是匿名的。選取2010年1月—2015年12月在本院肝膽胰脾外科接受治愈性肝切除術(shù)的208例HCC患者為研究對(duì)象，均獲得血清樣本、切除的腫瘤組織和癌旁肝組織樣本。排除接受過(guò)任何術(shù)前治療(如化療、乙醇注射或經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞)的患者。經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查證實(shí)了原發(fā)性HCC診斷。根治性切除定義為宏觀上完全切除腫瘤，組織學(xué)檢查陰性。208例患者的平均年齡為(59.0±13.56)歲，其中男162例(77.88%); 126例(60.58%)為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性, 63例(30.29%)為抗丙型肝炎病毒(HCV)陽(yáng)性, 31例(14.90%)有HCC家族史; 中位腫瘤直徑為5.0 cm[四分位距(IQR)為3.5～12.0 cm]; 病理檢查證實(shí)微血管侵犯105例(50.48%); 根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)第7版腫瘤、淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)[10]對(duì)HCC組織進(jìn)行分類(lèi), Ⅰ期54例, Ⅱ期84例, Ⅲ期70例; 84例(40.38%)為肝硬化。因此，大部分患者被診斷為慢性肝病、肝功能異常，平均吲哚菁綠15 min滯留率(ICG-R15)為(14.5±10.8)%(正常為0%～10%)。

1.2 樣本獲取和臨床資料收集

所有患者在手術(shù)前禁食≥10 h后采集血液樣本，立即分離血清并存儲(chǔ)于-80 ℃環(huán)境中。每個(gè)樣本只經(jīng)歷1次凍融。此外，手術(shù)切除后立即獲得組織標(biāo)本，在液氮中迅速冷凍, 24 h后轉(zhuǎn)移至-70 ℃環(huán)境中保存。前瞻性獲取術(shù)前臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)、切除標(biāo)本的組織學(xué)分析以及術(shù)后生存數(shù)據(jù)。詳細(xì)的臨床病理特征包括常規(guī)肝臟生化指標(biāo)、肝炎標(biāo)志物、血清甲胎蛋白(AFP)水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和血管浸潤(rùn)?；谔K木精-伊紅染色(HE染色)切片檢查進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。分析HCC標(biāo)本、血清中凝聚素表達(dá)與重要的臨床病理參數(shù)的關(guān)系，包括年齡、性別、抗HCV狀態(tài)、HBsAg狀態(tài)、血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、ICG-R15水平、血清白蛋白水平、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平、宏觀/微觀血管浸潤(rùn)和肝硬化。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中sCLU水平

采用ELISA試劑盒(捷克BioVendor Laboratory Medicine Inc公司)測(cè)定血清sCLU水平。所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品以一式兩份進(jìn)行評(píng)估，并計(jì)算平均值。首先將稀釋后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用移液管移入96孔板中，室溫下孵育2 h后洗滌平板，采用sCLU偶聯(lián)物孵育2 h; 然后加入底物溶液并在室溫下孵育30 min, 加入終止液終止反應(yīng)，在450 nm處通過(guò)Spectra Max 250酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices. 公司)讀板。sCLU濃度以μg/mL表示，并通過(guò)與參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估。

1.4 免疫組化法檢測(cè)組織sCLU蛋白表達(dá)

將組織標(biāo)本在4%多聚甲醛中4 ℃固定過(guò)夜，并使用自動(dòng)包埋機(jī)包埋在蠟中。此外，樣品通過(guò)一系列乙醇梯度脫水(70%、80%、90%、100%)后經(jīng)氯仿清洗，然后包埋在石蠟中。將再水化的組織切片用檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L, pH值6.0)微波處理，用3.0% H2O2孵育10 min，封閉液浸泡10 min。將組織切片與sCLU單克隆抗體(克隆B-5, 1∶200稀釋; 美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)在4 ℃的濕室中孵育過(guò)夜。此外，將組織切片載玻片用生物素標(biāo)記的二抗孵育10 min, 然后用鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物再處理10 min, 3, 3′-二氨基聯(lián)苯胺底物顯色10 min, Mayer′s蘇木精復(fù)染10 min。將載玻片安裝在顯微鏡下評(píng)估。采用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[11]: 陰性(-)為弱染色或未染色, (+)為<10%的腫瘤細(xì)胞中觀察到陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)≥10%的腫瘤細(xì)胞為中度染色()至強(qiáng)染色()。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血清sCLU水平與術(shù)后生存率的關(guān)系

208例HCC患者隨訪時(shí)間為2～130個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為58個(gè)月; 復(fù)發(fā)142例(68.27%), 復(fù)發(fā)時(shí)間為38.0個(gè)月; 隨訪期間死亡112例(53.85%)。所有患者術(shù)前血清sCLU水平為89.11(63.23, 119.47) μg/mL, 且血清sCLU水平與腫瘤分期無(wú)相關(guān)性; 單因素分析顯示，術(shù)前高sCLU水平(≥89.11 μg/mL,n=104)與低sCLU水平(<89.11 μg/mL,n=104)患者的生存期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=1.815,P=0.178)。見(jiàn)圖1。

A: 不同TNM分期患者血清sCLU水平比較; B: Kaplan-Meier生存曲線。

2.2 HCC和癌旁肝組織中sCLU的免疫組化染色結(jié)果

在115例(55.29%)腫瘤組織和81例(38.94%)癌旁肝組織中檢測(cè)到sCLU蛋白陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2。

A: 腫瘤組織,陰性; B: 腫瘤組織,陽(yáng)性; C: 配對(duì)的癌旁肝組織,陰性; D: 配對(duì)的癌旁肝組織,陽(yáng)性。圖2 免疫組化法檢測(cè)HCC腫瘤組織和癌旁肝組織中sCLU蛋白表達(dá)

2.3 HCC和癌旁肝組織中sCLU的免疫組化染色結(jié)果與術(shù)后生存率的關(guān)系

腫瘤組織中sCLU蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的無(wú)病生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=1.763,P=0.184); 癌旁肝組織中sCLU表達(dá)陽(yáng)性的患者的術(shù)后無(wú)病生存率低于sCLU表達(dá)陰性的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=9.853,P=0.002)。見(jiàn)圖3。生存分析結(jié)果顯示，癌旁肝組織sCLU蛋白表達(dá)與腫瘤組織sCLU蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(rs=0.679,P<0.001)。此外，癌旁肝組織sCLU陽(yáng)性表達(dá)者的腫瘤復(fù)發(fā)率為81.48%(66/81), 高于陰性表達(dá)者的59.84%(76/127), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.691,P=0.001)。HCC組織中sCLU陽(yáng)性表達(dá)者的腫瘤復(fù)發(fā)率為71.30%(82/115), 陰性表達(dá)者為64.52%(60/93), 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.094,P=0.296)。

A: 腫瘤組織sCLU蛋白表達(dá); B: 癌旁肝組織sCLU蛋白表達(dá)。

2.4 肝組織中sCLU蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤組織及癌旁肝組織中, sCLU蛋白陽(yáng)性表達(dá)者血清sCLU水平均高于陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，腫瘤組織sCLU蛋白表達(dá)與TNM分期有關(guān)(P=0.008), 而癌旁肝組織sCLU蛋白表達(dá)與其他臨床病理特征無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肝組織sCLU蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 影響HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床因素

單因素分析顯示，血清AFP>200 ng/mL、血清白蛋白≤4.0 g/dL、多發(fā)腫瘤、腫瘤直徑>5 cm、微血管浸潤(rùn)、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織中sCLU蛋白陽(yáng)性表達(dá)是影響HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 Kaplan-Meier法對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素生存分析[n(%)]

2.6 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

將重要的協(xié)變量從單變量分析進(jìn)入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。結(jié)果顯示，血清AFP>200 ng/mL、血清白蛋白≤4.0 g/dL、微血管浸潤(rùn)、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織sCLU蛋白陽(yáng)性表達(dá)是HCC患者術(shù)后無(wú)病生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。此外，多發(fā)腫瘤、微血管浸潤(rùn)、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織sCLU蛋白陽(yáng)性表達(dá)亦是影響HCC患者術(shù)后總生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 無(wú)病生存和總生存相關(guān)因素的多因素分析結(jié)果

3 討 論

本研究評(píng)估了HCC患者在腫瘤切除前的血清和切除組織(包括肝癌組織以及鄰近的癌旁肝組織)中sCLU濃度。本研究結(jié)果表明，術(shù)前血清sCLU水平、HCC腫瘤組織中sCLU蛋白表達(dá)情況與可切除HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)無(wú)相關(guān)性。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)癌旁肝組織中sCLU蛋白陽(yáng)性表達(dá)者較陰性表達(dá)者的預(yù)后更差。

研究[5]表明, sCLU與腫瘤集落蛋白的特性和腫瘤癌細(xì)胞的化學(xué)耐藥性相關(guān)[9, 12]。sCLU基因是一個(gè)單拷貝基因，位于染色體8p21～p12上，由9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子和1個(gè)5′-非翻譯區(qū)組成，編碼3種不同的人類(lèi)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。在人體中,sCLU基因可編碼2種蛋白質(zhì): sCLU蛋白(75～80 kDa)和nCLU蛋白(55 kDa)[6]。sCLU蛋白的前22個(gè)氨基酸代表一個(gè)經(jīng)典的疏水性先導(dǎo)信號(hào)序列，這些氨基酸被轉(zhuǎn)化成一個(gè)先導(dǎo)多肽，將蛋白質(zhì)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 22肽通過(guò)蛋白水解過(guò)程被去除，產(chǎn)生一個(gè)50 kDa的前體，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)一步加工成60 kDa的形式。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基復(fù)合體時(shí)，即被糖基化，進(jìn)一步分裂成2個(gè)40 kDa亞基，α 鏈和 β 鏈。然后，這2個(gè)亞基組裝成異二聚體絡(luò)合物，由5個(gè)二硫鍵連接。nCLU是由缺乏外顯子II剪接的mRNA合成的。第一和第三外顯子是拼接在一起的，放置第二幀外顯子III的第2個(gè)AUG序列作為翻譯起始位點(diǎn)。nCLUmRNA的翻譯產(chǎn)生了一種約49 kDa 的nCLU前體蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中，并保持休眠狀態(tài)。在全身電離輻射或細(xì)胞損傷后, nCLU前體蛋白經(jīng)過(guò)翻譯后修飾產(chǎn)生1個(gè)成熟的約55 kDa促凋亡蛋白形式，其具有N端和C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。研究[7, 14]表明, sCLU具有細(xì)胞保護(hù)作用和抗凋亡作用[6, 13], 而 nCLU蛋白具有促凋亡作用。

sCLU是一種異二聚硫酸化糖蛋白，牽涉到多種生物學(xué)功能，包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、衰老、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)、膜循環(huán)、細(xì)胞黏附和細(xì)胞程序性死亡等[5, 13]?；趕CLU在抗凋亡、血管生成和促轉(zhuǎn)移方面的作用, sCLU被證實(shí)與肝癌的進(jìn)程有關(guān)[15-16]。此外，鑒于其良好的診斷和預(yù)后表現(xiàn), sCLU也被推薦為多種癌癥的重要生物標(biāo)志物[16-20]。AL-MAGHRABI J A等[16]研究發(fā)現(xiàn), CLU在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)，可作為診斷標(biāo)志物，但是與疾病復(fù)發(fā)、生存或任何其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性。CHEN Q F等[17]也發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清CLU水平顯著高于正常對(duì)照組，且與臨床分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存率和無(wú)病生存率低有顯著相關(guān)性，提示血清CLU水平可能是診斷和評(píng)價(jià)乳腺癌化療敏感性的有效指標(biāo)。有研究[18]稱(chēng)，通過(guò)原位雜交檢測(cè), sCLU在大鼠肝細(xì)胞中以低基礎(chǔ)水平表達(dá)，在肝細(xì)胞生長(zhǎng)和促肝細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)下, sCLU表達(dá)上調(diào)。

既往研究[19-20]報(bào)道了使用免疫組織化學(xué)染色的人腫瘤組織中sCLU細(xì)胞質(zhì)過(guò)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在癌旁肝組織中有類(lèi)似的sCLU表達(dá)，在HCC組織的腫瘤細(xì)胞中有細(xì)胞質(zhì)和額外的微管分泌染色模式。本研究中, 55.29%的HCC組織表達(dá)sCLU, 38.94%的癌旁肝組織表達(dá)sCLU。本研究對(duì)癌旁肝組織中sCLU過(guò)表達(dá)與各種臨床病理參數(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示癌旁肝組織sCLU蛋白表達(dá)與肝功能惡化程度無(wú)關(guān)，因此其表達(dá)增加對(duì)HCC患者術(shù)后預(yù)后的影響可能只是與促癌分子機(jī)制有關(guān)，并不受肝硬化或纖維化的影響。本研究仍存在一些局限性: 本研究為單中心研究，樣本量相對(duì)較小; 本研究采用的數(shù)據(jù)庫(kù)主要基于HCC和乙肝病毒感染的患者隊(duì)列，應(yīng)該考慮對(duì)HCC和主要HCV感染人群或有酗酒史的人群進(jìn)行分層研究。

綜上所述，癌旁肝組織中的sCLU表達(dá)是與HCC患者術(shù)后無(wú)病生存和總生存都密切相關(guān)的獨(dú)立不良預(yù)后因素, sCLU在可切除HCC患者癌旁肝組織中表達(dá)上調(diào)，可作為HCC切除術(shù)后預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的有效靶點(diǎn)。