應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)有效表達(dá)PEDV纖突蛋白

郝建偉，薛春宜，曹永長

（1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 晉中 030600；2.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州 510006）

自2010年起，豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）變異毒株的蔓延對全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大影響，已有的疫苗及免疫策略已不能有效抵抗新型毒株的感染[1-3]。近年來，隨著PEDV疫苗研究的不斷深入，有效的疫苗結(jié)合不同免疫策略研究日益增多[4]。有研究顯示，弱毒疫苗免疫母豬被動保護(hù)仔豬，其仔豬成活率為66.7%～100%[4]，其中口服免疫保護(hù)率最高為100%，而肌肉注射保護(hù)率為80%[5-6]。全病毒滅活疫苗免疫母豬，仔豬存活率為80%～100%。有研究表明，肌肉注射方式保護(hù)率（91.7%～100%）[7-8]略優(yōu)于滴鼻免疫（80.0%～86.7%）[9-10]。S蛋白是PEDV重要的保護(hù)性抗原，目前已鑒定的具有中和抗體誘導(dǎo)活性的抗原表位均分布于S蛋白的S1和S2亞基。已有研究采用S蛋白制備亞單位疫苗肌肉注射免疫仔豬，結(jié)果表明，免疫仔豬排毒量顯著降低，腹瀉癥狀明顯減輕，仔豬存活率可達(dá)100%[11-13]。但PEDV粒子纖突蛋白含量較低且易受溫度和p H等因素的影響[14-15]。前期試驗結(jié)果表明，超速離心濃縮病毒易引發(fā)冠狀病毒纖突脫落，降低病毒感染性滴度，而感染性滴度在疫苗免疫保護(hù)中起著重要作用[16]。因此，完整的具備真核生物修飾的S糖蛋白可能是PEDV防控的重要選擇。

PEDV S蛋白的分子量較大，其成功表達(dá)需兼顧蛋白修飾和產(chǎn)量；而原核表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)因缺乏修飾或產(chǎn)量過低而難以有效進(jìn)行表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已被證明可用于多種病原抗原肽段的表達(dá)，目前，已有多個商業(yè)化產(chǎn)品被用于疫病防控。

由于昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞可識別的信號肽種類存在差異，而信號肽又會影響蛋白的表達(dá)效率[17-18]。因此，本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了PEDV全長S蛋白，并替換了蜂素信號肽的S蛋白，對比了替換信號肽對表達(dá)S蛋白的作用，采用表達(dá)蛋白免疫小鼠分析其免疫效果，旨在為PEDV新型疫苗的研制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 毒株和試驗動物

豬流行性腹瀉病毒變異毒株GDS01[19]由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用實驗室分離保存（GenBank登錄號：KM 089829）。小鼠免疫及測定試驗采用6周齡無特定病原菌（Specific pathogens free，SPF）Balb/c小鼠6只，購自中山大學(xué)試驗動物中心（在中山大學(xué)試驗動物中心飼養(yǎng)）。

1.2 主要儀器與試劑

大容量低速冷凍離心機(jī)和超速冷凍離心機(jī)（Beckman公司），H-I微型混合器（上海青浦徐新生化儀器廠），移液器和冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），電子天平（Sartorius公司），高壓鍋（Hirayama公司），Milli-Q超純水儀（Millipore公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司），梯度PCR儀、電泳儀（Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)和分光光度儀（Syngene公司），脫色搖床（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠），漩渦振蕩器（杭州儀表電機(jī)廠），制冰機(jī)和-20℃冷凍冰柜（日本SANYO公司），電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），4℃冷藏冰箱（海爾公司，青島），-80℃超低溫冰箱、生物安全超凈工作臺和細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），顯微鏡（Olympus公司），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（南京新辰生物科技有限公司），酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），分散機(jī)（IKA公司）。

TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DL 2000 Marker（Takara公司），Sf 9細(xì)胞培養(yǎng)基、Sf 9無血清培養(yǎng)基SF900II介質(zhì)、DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶和0.25%EDTA胰蛋白酶（GIBCO公司），轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Reagent和Trizol（Invitrogen公司），PVDF膜（Millipore公司），高純度質(zhì)粒純化提取試劑盒（Tiangen公司），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Axygen公司），蛋白質(zhì)Marker、限制性內(nèi)切酶和連接酶（Fermentas公司），Western-blot無蛋白封閉液（Kem-En-Tec公司），小鼠抗PEDV多抗和HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（實驗室自制），弗氏完全/不完全佐劑（Thermo公司）。其他各種化學(xué)試劑均為Sigma公司產(chǎn)品或國產(chǎn)化學(xué)分析純。

1.3 豬流行性腹瀉病毒S蛋白信號肽預(yù)測

GDS01毒株由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室保存，利用Trizol試劑參考說明書提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA模板。Vero細(xì)胞培養(yǎng)按照文獻(xiàn)[9]所述方法操作。利用Signal 4.0軟件預(yù)測S蛋白的信號肽。

1.4 表達(dá)替換信號肽S蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

設(shè)計PCR引物分別用于擴(kuò)增完整的S序列，去信號肽S基因片段和蜂素信號肽基因引物序列如 表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

將1μg經(jīng)測序驗證的質(zhì)粒加入100μL的DH 10Bac感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，42℃熱擊45 s，冰上冷卻3 min，加入900μL SOC液體培養(yǎng)基，37℃220 r/min培養(yǎng)4 h。取出菌液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為10、100、1 000，分別取100μL稀釋后的菌液涂布于含有三抗的LB平板，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)48 h。挑取平板上的白色菌落，在新的含有慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素3種抗生素LB平板上劃線，于37℃避光培養(yǎng)48 h后挑取單個白色菌落至含有上述3種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min培養(yǎng)6 h，取1μL菌液作為模板進(jìn)行PCR檢測。重組Bacmid DNA的提取步驟參考Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus System說明書中推薦方法進(jìn)行。

1.5 重組桿狀病毒的制備及表達(dá)蛋白的鑒定

Sf9昆蟲細(xì)胞生長于Sf9培養(yǎng)基中，在28℃條件下培養(yǎng)。用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后從細(xì)胞上清液中收取病毒作為第1代重組病毒（P1）；轉(zhuǎn)染后收獲的重組病毒經(jīng)過2次傳代后得到第3代重組病毒（P3），用蝕斑法對重組桿狀病毒進(jìn)行純化。

將收集到的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次，反復(fù)凍融3次，后用超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎后4℃，12 000×g下離心10 min，收集上清液，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮5 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。陰性對照為經(jīng)相同處理的感染空載體桿狀病毒的Sf9細(xì)胞，通過Western-blot鑒定含蜂素信號肽S重組蛋白。隨后進(jìn)行蛋白的膠內(nèi)酶解。手工切取經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠目的條帶，加入脫色液100μL（50%乙腈，50%mmol/L NH4HCO3）浸 泡，振 蕩20 min，棄 去 脫 色液，重復(fù)脫色1～2次至脫色液透明。加入50μL（10 mmol/L）DTT還原液，56℃作用30 min，棄去還原液，加入100μL乙腈脫水5～10 min，加入50μL（55 mmol/L）碘乙酰胺溶液烷基化，避光作用30 min，棄烷基化液，加入100μL脫色液，洗5～10 min，棄脫色液，凍干膠粒。

將經(jīng)胰酶消化的肽段用AB4800 Plus基質(zhì)輔助激光解析離子吸附-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDITOF-TOF）進(jìn)行分析，一級質(zhì)譜的質(zhì)量掃描范圍為800～3 500 ku，高豐度的母離子通過碰撞誘導(dǎo)解離進(jìn)一步形成離子碎片,質(zhì)譜由標(biāo)準(zhǔn)肽混合物作為外標(biāo)校正，根據(jù)肽質(zhì)量指紋（PMF）和串聯(lián)質(zhì)譜的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白鑒定。

獲得的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore軟件進(jìn)行分析，分析后的每一個樣品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個文件，使用MASCOT（Version 2.1，Matrix Science，U.K）搜索軟件對本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，鑒定蛋白質(zhì)。

1.6 免疫的樣品制備與免疫劑量

采用pH值為5.89的細(xì)胞裂解緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉，1.0 mmol/L EDTA，0.01%TritonX-100，5%丙三醇）裂解細(xì)胞，超聲破碎后離心去除細(xì)胞碎片，使用Milipore Ultra 100 ku超濾管對收獲液進(jìn)行超濾濃縮，步驟為5 000×g離心30 min。

利用倍比稀釋的BSA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定S蛋白質(zhì)量，免疫劑量按照小鼠常用劑量確定為100μL/只。按照1∶1的比例將抗原與弗氏佐劑混合乳化完全，樣品存放于4℃保存?zhèn)溆?，弗氏佐劑配制疫苗用于免疫小鼠。小鼠免疫分組情況如表2所示。

表2 小鼠免疫分組及免疫程序Tab.2 Different mouse immunization groups and the program

1.7 小鼠抗體檢測及細(xì)胞因子測定

采用中和試驗方法檢測試驗動物抗體水平[20]。小鼠細(xì)胞因子測定通過ELISPOT試驗檢測IL-4及IFN-γ細(xì)胞因子水平：第1天完成脾淋巴細(xì)胞分離及加入刺激物進(jìn)行培養(yǎng)試驗，按每孔3.0×105個細(xì)胞的細(xì)胞濃度將淋巴細(xì)胞加至活化的ELISPOT板中，每孔100μL。試驗組加入刺激物，設(shè)置正對照孔（加入佛波酯（PMA）2.5μg/mL）、負(fù)對照孔（只加細(xì)胞及培養(yǎng)基）和背景對照孔（不含細(xì)胞只加培養(yǎng)基和檢測試劑）。將ELISPOT板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

次日檢測細(xì)胞裂解及斑點。傾倒板內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基，4℃下放置10 min裂解板內(nèi)細(xì)胞，洗滌5～7次后拍干。將稀釋好的生物素標(biāo)記抗體加入各孔，每孔加入100μL后置于37℃孵育1 h，洗滌5次；將稀釋好的酶標(biāo)親和素工作液按100μL/孔加入后37℃孵育1 h，按上述洗滌方法洗滌5次后各孔加入AEC顯色工作液100μL/孔，37℃避光靜置15 min后傾倒孔內(nèi)液體，打開ELISPOT板底座，用去離子水反復(fù)沖洗正反面終止顯色，將其放置在室溫陰涼處晾干，后用ELISPOT讀板儀進(jìn)行斑點計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV S蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

利用Signal 4.0軟件對S蛋白信號肽進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，S蛋白前20個氨基酸為蛋白信號肽，信號肽氨基酸序列為MKSLTYFWLFLP VLSTLSLP。

2.2 表達(dá)替換信號肽S蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac表達(dá)S蛋白和替換信號肽S蛋白，將S基因和替換信號肽S基因分別插入p FastBacDual質(zhì)粒p H啟動子下，獲得重組質(zhì)粒p FastBacDual-Sph和p FastBacDual-MelSph，利用雙酶切鑒定質(zhì)粒，結(jié)果如圖2-A所示，酶切后載體片段長約5 238 bp，S為4 158 bp，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。送酶切成功的質(zhì)粒至公司測序。質(zhì)粒p FastBacDual-MelSph測序結(jié)果正確，轉(zhuǎn)化DH 10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選試驗成功獲得含重組質(zhì)粒細(xì)胞，PCR鑒定結(jié)果為陽性質(zhì)粒（圖2-B）。

2.3 重組桿狀病毒的制備及表達(dá)蛋白的純化與鑒定結(jié)果

提取重組質(zhì)粒并計算濃度后，轉(zhuǎn)染單層Sf9細(xì)胞，48 h后顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時收獲P1病毒并命名為rB-PEDV S，P1病毒經(jīng)3次噬斑克隆純化后，感染Sf9細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，用Western-blot法檢測S重組蛋白的表達(dá)（圖3），常規(guī)S蛋白表達(dá)步驟同上。SDS-PAGE膠內(nèi)酶解蛋白分離結(jié)果顯示，成功獲得重組蛋白（圖4），利用MALDI-TOF-TOF分析確認(rèn)S蛋白及替換信號肽S蛋白表達(dá)（表3）。

表3 分離蛋白MALDI-TOF-TOF鑒定結(jié)果Tab.3 MALDI-TOF-TOF identification results of separated protein

2.4 免疫樣品的制備與免疫劑量確定

用PBS稀釋BSA，得到0.01、0.02、0.04μg/μL共3個質(zhì)量濃度定量溶液；利用SDS-PAGE半定量方法繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線（由于SDS-PAGE分辨率有限，因此該方法僅可用于替換信號肽S重組蛋白的定量）。將替換信號肽S蛋白PAGE數(shù)值代入BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可知S質(zhì)量濃度為0.008 608μg/μL，小鼠每次免疫劑量為0.86μg/只。

2.5 小鼠抗體檢測及細(xì)胞因子測定結(jié)果

免疫后采集血清測定中和抗體效價，結(jié)果顯示，替換信號肽S蛋白免疫組與PBS組并無明顯差異；2種細(xì)胞因子測定結(jié)果顯示，替換信號肽S蛋白免疫組小鼠IFN水平略高于PBS組，與未濃縮病毒免疫組相似，而免疫S蛋白小鼠IL-4水平則高于PBS免疫組（圖5）。

3 結(jié)論與討論

纖突蛋白是冠狀病毒主要的抗原蛋白，新型疫苗往往以該蛋白作為目標(biāo)抗原進(jìn)行深入研究。PEDV作為冠狀病毒家族成員之一，其成功預(yù)防同樣依賴S蛋白的參與。S蛋白是保持病毒感染性及良好抗原性的關(guān)鍵因素，但由于其占病毒蛋白含量比例較低且易脫落，常導(dǎo)致疫苗質(zhì)量難以得到很好控制；同時，PEDV培養(yǎng)困難，病毒滴度難以提升更加減少了有效抗原含量。PEDV S蛋白分子質(zhì)量約為180 ku，巨大的分子質(zhì)量常常導(dǎo)致其難以表達(dá)。本研究在采用昆蟲桿狀表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)完整S蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析利用易被昆蟲細(xì)胞識別的蜂素信號肽替換原有信號肽，結(jié)果表明，替換信號肽后S蛋白表達(dá)量上升。

S蛋白具有跨膜區(qū)，表達(dá)后會錨定在細(xì)胞膜上。本研究通過收集感染重組病毒的病變細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞釋放表達(dá)蛋白，進(jìn)一步超聲破碎后離心去除細(xì)胞碎片，結(jié)果顯示，蛋白純度雖有較大提升，但是由于中間步驟過多等原因未達(dá)到濃縮蛋白的目的。

利用S蛋白制備疫苗免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S蛋白可激發(fā)小鼠產(chǎn)生IL-4，其他免疫指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)差異，其原因可能主要有2個方面：一方面，蛋白分子量過大導(dǎo)致難以高效表達(dá)，導(dǎo)致疫苗免疫劑量不足。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)啟動子均為極晚期啟動子，目的蛋白的表達(dá)時間段為細(xì)胞病變明顯時，此時細(xì)胞已呈現(xiàn)病理狀態(tài)，多種輔助蛋白翻譯因子的缺失會影響目的蛋白的表達(dá)。有文獻(xiàn)報道，真核起始因子4e（eIF4e）與目的蛋白共表達(dá)會提升蛋白產(chǎn)量[18]。本研究也嘗試在p FastBacDual質(zhì)粒的p10啟動子中連入eIF4e，結(jié)果顯示，目的蛋白表達(dá)量并未提升。此外，有研究提到優(yōu)化起始密碼子周圍序列有助于蛋白表達(dá)[21]，本研究利用重疊PCR將Kozak序列克隆至目的序列的5′端，結(jié)果顯示，蛋白表達(dá)量無明顯提升，僅當(dāng)S信號肽替換為可被昆蟲細(xì)胞識別的蜂素信號肽時蛋白表達(dá)有所提升。另一方面，SARS及IBV等病毒的免疫研究顯示，冠狀病毒的免疫保護(hù)易受多種因素影響。要成功地預(yù)防控制就需依賴成熟的病毒粒子，單獨的S蛋白可能難以有效激發(fā)產(chǎn)生良好的保護(hù)[22]。此外，蛋白的純化過程中殘留的雜蛋白也可能會對免疫效果產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究聚焦于提高PEDV S蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，當(dāng)采用蜂素信號肽替換原有信號肽時，可提升蛋白表達(dá)量。小鼠細(xì)胞因子測定結(jié)果表明，在以0.86μg/只劑量免疫時可有效激發(fā)小鼠體內(nèi)IL-4產(chǎn)生。后續(xù)應(yīng)以桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的S蛋白免疫仔豬進(jìn)行進(jìn)一步的研究。