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    新鮮枸杞葉中黃酮提取工藝的優(yōu)化及抗氧化性分析

    2022-05-17 07:47:38繆文玉李冠文殷孝瑩
    山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:葉中提取液枸杞

    繆文玉,李冠文,殷孝瑩,秦 楠

    (1.太原城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院 管理工程系,山西 太原 030027;2.山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院,山西 晉中 030619)

    寧夏枸杞是中國(guó)藥典中最好的唯一藥用品種,其根、葉、花、果實(shí)均可入藥。枸杞葉(Lycium barbarumleaves)是茄科枸杞屬植物枸杞(LyciumbarbarumL.)的嫩葉,其性味苦、甘、澀,具有補(bǔ)腎益精、清熱明目、延緩衰老等功效[1]。現(xiàn)代研究表明,枸杞葉藥理作用復(fù)雜多樣,主要有抗衰老[2]、降血糖、降血脂[3-4]、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化[5-6]等作用且從枸杞葉化學(xué)成分來(lái)看,其所含活性成分有生物堿、黃酮、多糖、酚類、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、微量元素以及萜類化合物等,其中,以多糖類以及黃酮類化合物的含量較高,因而現(xiàn)代學(xué)者對(duì)枸杞葉中這2種化合物的研究較為廣泛。崔今[7]通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS法)對(duì)枸杞葉干藥材提取物進(jìn)行鑒定,研究表明,枸杞葉提取物是由11種黃酮類化合物組成,且藥理作用研究發(fā)現(xiàn)黃酮提取物可以達(dá)到顯著的降血糖效果。范艷麗等[8]的研究結(jié)果證實(shí)了枸杞葉干藥材黃酮提取物對(duì)超氧陰離子、·OH、DPPH、亞硝基以及ABTS自由基具有顯著的清除能力,因而得出黃酮提取物是天然的氧化劑的初步結(jié)論。呂海英等[9]研究發(fā)現(xiàn),黑果枸杞葉中的黃酮類化合物具有顯著的抗衰老、降血脂作用,推測(cè)可能與其中的蘆丁、槲皮素、木犀草素、異鼠李素及山奈素成分的含量息息相關(guān)。干藥材枸杞葉中富含較多活性成分且具有豐富的藥理作用,為本試驗(yàn)研究新鮮枸杞葉活性成分及抗氧化活性奠定了堅(jiān)實(shí)了理論基礎(chǔ)。

    枸杞葉黃酮類成分的提取以往大多采用有機(jī)溶劑提取法,該法存在有機(jī)溶劑消耗量大、回流時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn),而近幾年新興起的超聲波輔助酶解提取法具有耗時(shí)短、酶解速度快、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),因此,本試驗(yàn)選用該提取法進(jìn)行研究。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥材枸杞屬枸杞的化學(xué)成分、藥理作用等研究主要集中在不同品種枸杞子以及黑果枸杞葉等,對(duì)寧夏枸杞葉研究多為干燥枸杞葉而對(duì)新鮮寧夏枸杞葉沒(méi)有相關(guān)研究。新鮮枸杞葉廉價(jià)易得、無(wú)任何前處理操作,可有效減少有效成分的損失。因此,本試驗(yàn)以新鮮寧夏枸杞葉為原材料,利用超聲波輔助酶解法手段提取枸杞葉中總黃酮,并通過(guò)BoXbenhnken設(shè)計(jì)分析得到最佳提取工藝參數(shù),在此基礎(chǔ)上初步探討新鮮枸杞葉黃酮提取液的抗氧化活性,旨在為新鮮枸杞葉的綜合利用提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料及試劑

    新鮮枸杞葉采摘于寧夏枸杞種植基地。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);纖維素酶(鄭州宇控生物科技有限公司);無(wú)水乙醇(AR)、硫酸亞鐵(AR)、水楊酸(AR)、過(guò)硫酸鉀(AR)、30%過(guò)氧化氫(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);硝酸鋁(AR)、亞硝酸鈉(AR)(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司);氫氧化鈉(天津市東麗區(qū)南孫莊村西工業(yè)區(qū));Vc、·OH、DPPH、ABTS(純度均>99%)(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 超聲波輔助酶解法提取黃酮化合物 將新鮮枸杞葉洗凈、干燥、粉碎,精密稱取約1.0 g枸杞葉粉末,加入16 mg纖維素酶混合均勻,加入30 mL 60%乙醇溶液后調(diào)節(jié)pH值至5.0,置于40℃水浴鍋中酶解30 min,然后將其轉(zhuǎn)移至超聲波清洗機(jī)中于超聲溫度50℃、超聲功率500 W條件下超聲提取30 min,抽濾。所得濾餅按照上述操作再次提取后合并2次濾液,最后定容至1 000 mL容量瓶中備用(圖1)。

    1.2.2 超聲波輔助酶解法的單因素試驗(yàn)

    1.2.2.1 超聲溫度對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1步驟操作,固定料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率500 W,考察不同超聲溫度(30、40、50、60、70℃)提取條件下對(duì)枸杞葉總黃酮提取率的影響。

    1.2.2.2 超聲功率對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1步驟操作,固定超聲溫度50℃、料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,考察不同超聲功率(100、200、300、400、500 W)提取條件下對(duì)枸杞葉總黃酮提取率的影響。

    1.2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1步驟操作,固定超聲溫度50℃、料液比1∶20、超聲功率500 W,考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(55%、60%、65%、70%、75%)提取條件下對(duì)枸杞葉總黃酮提取率的影響。

    1.2.2.4 料液比對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1的步驟操作,固定超聲溫度50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率500 W,考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)提取條件下對(duì)枸杞葉總黃酮提取率的影響。

    1.2.3 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì) 按照Box-benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以考察新鮮枸杞葉中黃酮提取率(Y)為最終目的,選定超聲溫度(A)、超聲功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(D)共4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì),各因素水平如表1所示。

    表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Tab.1 Design factors and level s of response surface test

    1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及黃酮提取率的計(jì)算 參照丁建海等[10]的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法,在400~600 nm波長(zhǎng)下確定黃酮化合物的最大吸收波長(zhǎng),在最大吸收波長(zhǎng)下繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確量取新鮮枸杞葉黃酮提取液1 mL,按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法測(cè)定吸光度A值,計(jì)算黃酮提取率。

    式中,W表示新鮮枸杞葉中黃酮提取率(%);C表示新鮮枸杞葉黃酮提取液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V1表示新鮮枸杞葉黃酮提取液的體積(mL);V2表示稀釋倍數(shù);m表示藥材取樣量(mg)。

    1.2.5 黃酮提取液的抗氧化性研究 按上述最佳制備工藝所得的黃酮提取液濃縮至恒質(zhì)量,稱取5 mg放于燒杯中,用適量65%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容至刻度線即可得到5 mg/mL的樣品溶液。取3 mL該樣品溶液于4個(gè)不同容量瓶中用65%乙醇分別稀釋至15.0、7.5、5.0、3.75 mL,即可得到質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4 mg/mL的樣品溶液。將上述5個(gè)不同質(zhì)量濃度樣品溶液采用段亞云等[11]的方法進(jìn)行DPPH自由基的清除活性測(cè)定;采用鄭朝華等[12]的方法進(jìn)行OH自由基的清除活性測(cè)定;采用何蘭香等[13]的方法進(jìn)行ABTS自由基的清除活性測(cè)定。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Design-Expert V 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件分析,應(yīng)用最小差異顯著法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示,新鮮枸杞葉黃酮提取液的適宜檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm,且當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度在0~0.6 mg/mL時(shí),濃度(X)與吸光度值(Y)的線性相關(guān)程度最好,線性方程為y=14.684x+0.028 1(R2=0.990 1),R2接近于1,表明在此區(qū)間y與x表現(xiàn)出較好的等比增長(zhǎng)關(guān)系,適宜用此方程式進(jìn)行后續(xù)樣品濃度的換算。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 超聲溫度對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 由圖3可知,超聲溫度的升高造成黃酮類化合物提取率呈現(xiàn)出急速上升后緩慢下降的現(xiàn)象,超聲溫度50℃時(shí)所對(duì)應(yīng)的黃酮提取率最高(4.5%)。高于50℃后提取率下降,推測(cè)可能是因?yàn)槌暅囟瓤梢詫㈣坭饺~細(xì)胞破碎增強(qiáng)空化作用,加速化學(xué)成分的溶出;當(dāng)超聲溫度高于一定程度后,由于高溫導(dǎo)致空化作用減弱阻礙了黃酮化學(xué)成分的溶出[14]。因此,選擇超聲溫度50℃進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

    2.2.2 料液比對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響料液比對(duì)化學(xué)成分的溶出具有重要作用,由圖4可知,新鮮枸杞葉中黃酮提取率隨著料液比的增大表現(xiàn)為先上升后逐漸下降趨勢(shì),在料液比為1∶25時(shí),黃酮提取率達(dá)到最高(3.7%),而此料液比后提取率下降的原因可能是由于原材料用量固定的情況下溶劑用量倍增造成新鮮枸杞葉中黃酮類化合物溶出率達(dá)到飽和,而其易溶于乙醇化學(xué)成分的逐步溶出影響了黃酮的分離[15]。因此,選擇料液比1∶25進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

    2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 由圖5可知,不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)醇溶性物質(zhì)的溶出影響程度不同。新鮮枸杞葉黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),并于體積分?jǐn)?shù)65%乙醇下達(dá)到最高(3.8%),此后提取率均低于此值。預(yù)測(cè)造成黃酮提取率下降的原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高導(dǎo)致更多脂溶性物質(zhì)析出從而降低了目標(biāo)物的溶出率[16-17]。因此,選用65%乙醇進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

    2.2.4 超聲功率對(duì)新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 從圖6可以看出,超聲功率對(duì)黃酮類化合物提取率的影響程度較小,功率小于300 W時(shí)黃酮提取率趨于平穩(wěn);當(dāng)功率達(dá)到300~400 W時(shí)黃酮類化合物提取率有效升高最終達(dá)到臨界值(3.3%);超聲功率大于400 W后新鮮枸杞葉黃酮提取率驟然下降,其原因可能是由于功率在100~300 W時(shí)枸杞葉細(xì)胞內(nèi)黃酮受熱效應(yīng)影響而加速溶解,當(dāng)功率高于400 W時(shí),溫度隨之升高造成乙醇部分揮發(fā)影響了總黃酮的溶出[18]。因此,選用超聲功率400 W進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

    2.3 提取工藝的優(yōu)化

    2.3.1 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化 超聲溫度(A)、超聲功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(D)對(duì)黃酮提取率(Y)影響的具體數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸,得到回歸模型方程:Y=5.59+0.35A-0.47B+0.68C+0.098D-0.41AB+0.48AC-0.16AD-0.67BC-1.21BD-0.73CD+0.13A2-0.33B2+0.051C2+0.17D2。

    根據(jù)表2中P值大小得出,對(duì)黃酮提取率的影響因素由大到小依次為C>B>A>D。模型中交互項(xiàng)AB、AC、BC、BD、CD對(duì)黃酮提取率均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05),且交互項(xiàng)BC、BD、CD達(dá)到極顯著水平(P<0.01),其中,失擬誤差P值為0.981 0>0.05,表明多元二次回歸模擬方程可以充分說(shuō)明各因素與提取率之間的函數(shù)關(guān)系,模型不必再選擇更高級(jí)別函數(shù)。相關(guān)系數(shù)R2=0.964 8與R2Adj=0.929 7趨近于100%,代表方程模型與試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)契合度較高。模型的P<0.001,證實(shí)模型與試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)擬合效果絕佳,可以用于新鮮枸杞葉中黃酮提取率的理論預(yù)測(cè)。

    表2 模型的方差分析Tab.2 Variance analysis of the model

    響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)建立的曲面模型可以對(duì)影響黃酮提取率的單因素以及兩因素之間的交互作用作出評(píng)價(jià),從而確立最佳水平范圍。3D響應(yīng)曲面圖中不同的傾斜度、顏色及整體趨勢(shì)可以反映出兩坐標(biāo)軸對(duì)應(yīng)的因素之間對(duì)響應(yīng)值即黃酮提取率的影響程度[19]。由圖7可知,BC、BD、CD交互作用曲面傾斜度相比其他較高,且曲面顏色可以直觀看到呈現(xiàn)加深趨勢(shì),而AD交互作用曲面傾斜度一般、顏色無(wú)明顯變化,說(shuō)明BC、BD、CD兩者之間交互作用較顯著,表現(xiàn)為響應(yīng)值變化趨勢(shì)劇烈增加。圖7所示的各響應(yīng)面形態(tài)各異且頂點(diǎn)都在試驗(yàn)水平范圍內(nèi),說(shuō)明黃酮提取率最佳優(yōu)化條件在試驗(yàn)的水平范圍內(nèi)。

    2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 考慮到實(shí)際操作的可行性,數(shù)據(jù)分析所得最佳提取工藝(超聲溫度58.18℃、超聲功率320.69 W、料液比1∶28.96、乙醇體積分?jǐn)?shù)67.22%)經(jīng)調(diào)整后修正為60℃、超聲功率300 W、料液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%,經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證后得到新鮮枸杞葉中黃酮實(shí)際提取率為7.742 1%,與理論值(7.706 1%)相差0.036百分點(diǎn),因此,試驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所得模型的擬合度較高、產(chǎn)生的誤差較小,用模型確定的方程式預(yù)測(cè)新鮮枸杞葉中黃酮提取率的方法可信度很高。

    2.4 黃酮提取液的抗氧化性

    2.4.1 新鮮枸杞葉黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力 DPPH[20-21]作為具有單一電子、穩(wěn)定的自由基,在有機(jī)溶劑中呈現(xiàn)特殊的紫色反應(yīng),而抗氧化劑的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的紫色變淺,從而發(fā)生由于強(qiáng)抗氧化性而造成吸光度值減小的現(xiàn)象。從圖8可以看出,黃酮提取液質(zhì)量濃度升高,造成清除率逐漸增大,當(dāng)質(zhì)量濃度在3~5 mg/mL時(shí)清除率趨于平穩(wěn),在5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)86.48%,可以看出,此樣液對(duì)DPPH自由基具有一定的消除作用,且最終受濃度的影響會(huì)變小。

    2.4.2 新鮮枸杞葉黃酮提取液對(duì)·OH自由基的清除能力 Fe2+、H2O2與水楊酸發(fā)生反應(yīng)所得產(chǎn)物·OH自由基于510 nm波長(zhǎng)下有特殊吸收,當(dāng)樣品中存在可與·OH自由基反應(yīng)的物質(zhì)時(shí),由于有色化合物產(chǎn)率減少,從而造成吸光度值降低,并可得出樣品抗氧化活性增強(qiáng)的結(jié)論[22]。從圖9可以看出,清除率隨著樣液質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大,在5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)80.36%,以上結(jié)果顯示,不同質(zhì)量濃度的新鮮枸杞葉提取液對(duì)·OH自由基有近似呈正相關(guān)線性關(guān)系的消除作用。

    2.4.3 新鮮枸杞葉黃酮提取液對(duì)ABTS自由基的清除能力 供試品對(duì)ABTS自由基有清除活性的基本思路為:K2S2O8與ABTS反應(yīng)生成穩(wěn)定的ABTS+,供試品由于含抗氧化物質(zhì)可與ABTS+反應(yīng)得到最終產(chǎn)物,因此,使原溶液褪色造成吸光度值降低[23]。由圖10可知,隨著新鮮枸杞葉的提取液質(zhì)量濃度逐步升高,對(duì)ABTS自由基的清除能力呈現(xiàn)平穩(wěn)-輕微下降-迅速上升的趨勢(shì)。出現(xiàn)輕微下降的原因可能是供試品質(zhì)量濃度太低導(dǎo)致吸光度數(shù)據(jù)差距較小,此差距低于儀器檢測(cè)下限,造成儀器檢測(cè)是近似認(rèn)為無(wú)顯著差異。當(dāng)達(dá)到一定質(zhì)量濃度后,由于質(zhì)量濃度差距增大導(dǎo)致吸光度上升。結(jié)果顯示,黃酮提取液質(zhì)量濃度在5 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)67.06%,證實(shí)該提取液對(duì)ABTS自由基有消除效果且與質(zhì)量濃度高低呈正相關(guān),因此,新鮮枸杞葉黃酮提取液在一定程度上具有抗氧化能力。

    3 結(jié)論與討論

    超聲波可以產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用,結(jié)合提取溶劑的滲透作用可以達(dá)到破壞中藥材植物的細(xì)胞壁、有效加大溶劑與目標(biāo)物的接觸面積的效果,從而縮短化學(xué)成分的溶出時(shí)間,提高有效成分的提取率。超聲波提取法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各中藥材活性成分的提取方式,為活性成分的溶出提供了有利的后天條件。張鷹等[24]采用超聲波提取法得到枸杞葉中黃酮提取率為5.62%,小于本試驗(yàn)新鮮枸杞葉黃酮提取率(7.742 1%),造成此現(xiàn)象的原因可能是本試驗(yàn)采用了超聲波輔助酶解方法。

    隨著酶解法在提取手段上突顯出的優(yōu)勢(shì),酶解提取、超聲波輔助酶解提取法等新型提取方式隨之產(chǎn)生,且極大提高了化學(xué)成分的提取率、增強(qiáng)了道地藥材的生物利用度。然而由于不同酶的作用不同,產(chǎn)生的效果也不盡相同。陳書明[25]研究發(fā)現(xiàn),不同水解酶對(duì)杜仲葉總黃酮的提取率影響效果依次為蛋白酶>單寧酶>纖維素酶>果膠酶。而戢得蓉等[26]等對(duì)比不同水解酶對(duì)雪蓮果葉總黃酮提取率的影響,得出各種水解酶的提取率依次為纖維素酶>果膠酶>蛋白酶。因此,可以看出纖維素酶的利用度最好。本試驗(yàn)選用纖維素酶進(jìn)行酶解的原因除利用度較好外,還考慮到纖維素酶的特性。纖維素酶是專門用于降解纖維素的一種非單體的復(fù)合酶,是具有共同作用的多樣化酶系,其中富含的酶活力越高產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物越徹底[27-28]。本研究前期對(duì)比了多家公司生產(chǎn)的纖維素酶,最終選定酶活力相對(duì)較好的鄭州宇控生物科技有限公司生產(chǎn)的纖維素酶?;诖松蟽?yōu)點(diǎn),本研究選用纖維素酶破壞植物細(xì)胞壁,利用超聲波輔助酶解的優(yōu)勢(shì)使細(xì)胞內(nèi)的活性成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以大幅度溶出,從而達(dá)到本試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,超聲波輔助酶解法提取新鮮枸杞葉黃酮的手段是切實(shí)可行的,經(jīng)響應(yīng)曲面法分析優(yōu)化后得到新鮮枸杞葉黃酮的最佳提取條件為:超聲溫度60℃、超聲功率300 W、料液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%,在此條件下,黃酮實(shí)際提取率為7.742 1%。此外,由抗氧化活性數(shù)據(jù)可以得出,最佳工藝條件制備所得的不同新鮮枸杞葉黃酮提取液質(zhì)量濃度對(duì)各項(xiàng)自由基有不同的清除效果。當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),DPPH、·OH和ABTS自由基對(duì)應(yīng)的清除率分別為86.48%、80.36%、67.06%??傊?,采用超聲輔助酶解提取得到新鮮枸杞葉中黃酮提取率較高,對(duì)進(jìn)一步研究其功效具有深遠(yuǎn)意義。

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