直播稻金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

李軍玲 張紅磊 張融雪 蔡昱萌 汪穎 佟卉 劉燕清 蘇京平

摘要 [目的]建立高效的金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。[方法]以直播稻品種金粳818成熟胚為外植體，設計4種誘導培養(yǎng)基，篩選適合金粳818的誘導條件;設計5種分化培養(yǎng)基，篩選適合金粳818的分化條件;獲得的愈傷組織用農(nóng)桿菌介導法進行轉(zhuǎn)基因再生。[結(jié)果]最佳誘導培養(yǎng)基為4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D，誘導率為89.3%;最佳分化培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，分化率為81.1%，成苗率為52.1%;經(jīng)PCR分子檢測，再生幼苗100%為轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)論]該研究建立了金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系，為品種定向改良奠定了技術基礎。

關鍵詞 金粳818;成熟胚;愈傷組織;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號 S 511? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）09-0100-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.024

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of Genetic Transformation System of Mature Embryo of Direct Seeding Japonica Rice Variety Jingeng 818

LI Jun-ling， ZHANG Hong-lei， ZHANG Rong-xue et al

（Crop Research Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding， Tianjin 300384）

Abstract [Objective]To establish an efficient genetic transformation system of Jingeng 818. [Method]Using the mature embryo of direct seeding rice variety Jingeng 818 as explant， four induction medium schemes were designed to obtain the suitable induction conditions of Jingeng 818;five kinds of differentiation medium were designed to obtain the suitable differentiation condition for Jingeng 818; and the obtained callus was used to establish the transgenic regeneration system by agrobacterium mediated method. [Result]The results showed that the best induction medium was 4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D with the induction rate 89.3%. The best differentiation medium was MS+5.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA with the differentiation rate 82.1% and the seedling rate 52.1%. By PCR molecular detection， 100% of the regenerated seedlings were transgenic positive plants.[Conclusion] In this study， the genetic transformation system of mature embryo of Jingeng 818 was established， which laid a technical foundation for directional improvement of varieties.

Key words Jingeng 818;Mature embryo;Callus;Genetic transformation

水稻是我國第一大口糧作物，水稻生產(chǎn)事關國家口糧安全。稻田雜草防除是生產(chǎn)中的棘手問題，由于禾本科雜草、雜草稻等與水稻親緣關系較近，常規(guī)除草劑對其無效，培育具有除草劑抗性水稻品種能較好地解決稻田草害問題。金粳818是天津市水稻研究所選育的具有除草劑抗性的粳型常規(guī)水稻品種，為采用生物技術手段對金粳818進行改良而培育的新種質(zhì)，可為除草劑抗性水稻提供新材料，其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立尤為重要。

利用愈傷組織再生體系進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化是最廣泛應用的方法之一，具有明顯優(yōu)點，如外植體來源廣泛、周期短、易于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化效率高等[1];農(nóng)桿菌介導法是水稻遺傳轉(zhuǎn)化首選方法，具有易操作、低拷貝、基因沉默少、遺傳穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢[2]。相比秈稻而言，粳稻愈傷誘導率和分化再生率較高，不少粳稻品種的組織培養(yǎng)再生體系已經(jīng)建立且轉(zhuǎn)基因體系成熟，如日本晴、中花11、秀水134等[3-7]。影響水稻愈傷組織誘導率、分化率和再生率的主要因素是基因型[8]，而品種間基因型的差異導致尚缺乏統(tǒng)一的配方適合所有品種。筆者以成熟胚為外植體，設計了4種不同誘導培養(yǎng)基摸索適宜誘導條件，設計5種分化培養(yǎng)基，利用獲得的愈傷組織以農(nóng)桿菌介導法進行轉(zhuǎn)基因再生，建立高效的金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用生物技術定向改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以天津市水稻研究所自主育成的金粳818成熟胚為外植體。含有pCAMBIA1301質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌由天津市農(nóng)作物遺傳育種重點實驗室保存。培養(yǎng)基NB（貨號N492）和MS（貨號M519）及激素均購自Phytotechnology。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 誘導培養(yǎng)基?；A培養(yǎng)基+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+3.5 g/L 植物凝膠+2，4-D（表1），調(diào)節(jié)pH為5.8。

1.2.2 篩選培養(yǎng)基。4.1 g/L NB+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+3.5 g/L? 植物凝膠+2 mg/L 2，4-D+40 μg/L潮霉素+400 μg/L青霉素，調(diào)節(jié)pH為5.8。

1.2.3 分化培養(yǎng)基。4.43 g/L MS+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 山梨醇+30 g/L蔗糖+3.5 g/L 植物凝膠+30 μg/L潮霉素+300 μg/L青霉素+不同激素組合（表2），調(diào)節(jié)pH為5.8。

1.2.4 生根培養(yǎng)基。2.215 g/L MS+30 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝膠+20 μg/L潮霉素+200 μg/L青霉素，調(diào)節(jié)pH為5.8。

1.2.5 AAM侵染液。4.1 g/L NB+68 g/L蔗糖+36 g/L 葡萄糖+0.5 g/L水解酪蛋白+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L L-谷氨酰胺+177 mg/L L-精氨酸+7.5 mg/L甘氨酸+300 mg/L L-天冬氨酸+2.5 mg/L 2，4-D，調(diào)節(jié)pH為5.2，使用前加入0.5 mL濃度為20 mg/L乙酰丁香酮。

1.3 方法

1.3.1 金粳818成熟胚愈傷組織誘導。收取當年新的金粳818成熟種子，剝離穎殼，取適量倒入50 mL離心管中，75%乙醇消毒1 min，30%次氯酸鈉（有效氯3%）消毒15 min，無菌水沖洗5～6次，去除多余水分，倒入鋪有3層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，無菌風吹干15 min。最后接種到誘導培養(yǎng)基中，每皿25～35粒種子，28 ℃暗培養(yǎng)10 d，在水稻幼芽和成熟胚之間長出淡黃色、結(jié)構致密的胚性愈傷組織，掐芽剝離出愈傷后放入新的誘導培養(yǎng)基上3～5 d即可進行轉(zhuǎn)化，誘導10 d后統(tǒng)計誘導率。

誘導率=出愈傷的成熟胚數(shù)量/總成熟胚數(shù)量×100%

1.3.2

農(nóng)桿菌培養(yǎng)及浸染。將含有pCAMBIA1301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105在YEP（含25 mg/L卡那霉素）固體平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)2 d。刮取平板上的農(nóng)桿菌至AAM浸染液中，調(diào)整菌體濃度至OD600值為0.3～0.5，獲得農(nóng)桿菌懸浮液。挑取足夠數(shù)量的愈傷組織放入無菌三角瓶中，加入農(nóng)桿菌懸浮液，室溫放置浸染20 min，并間隔晃動幾次，倒掉菌液，將愈傷組織放置無菌濾紙上吸去多余菌液，轉(zhuǎn)移至鋪有一層無菌濾紙的固體培養(yǎng)基上，26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。

1.3.3 篩選培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后的愈傷組織，用無菌水清洗2次，用含有500 μg/mL羧芐青霉素的無菌水沖洗1次，吸去多余水分后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌濾紙上，晾干，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，28 ℃，暗培養(yǎng)30 d。

1.3.4 分化再生。篩選30 d后，在原愈傷的底部可見顏色淡黃、結(jié)構致密、直徑1～2 mm的陽性愈傷長出，挑取陽性愈傷到分化培養(yǎng)基上進行分化再生，培養(yǎng)條件為28 ℃，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。15～20 d統(tǒng)計分化率，25～35 d統(tǒng)計成苗率。

分化率=分化的愈傷組織數(shù)量/總愈傷組織數(shù)量×100%

成苗率=分化的幼苗數(shù)量/分化的愈傷組織數(shù)量×100%

1.3.5 生根培養(yǎng)及馴化。分化出的幼苗長到2～3 cm有明顯根系時，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件28 ℃，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。7～10 d后，幼苗長出大量側(cè)根，當小苗長至高10～15 cm時，打開蓋子在室外煉苗2～3 d，取出小苗后洗去根部培養(yǎng)基，移栽至土中。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因植株鑒定。CTAB法提取幼苗DNA，并用潮霉素基因引物檢測植株。

hygF：ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC

hygR：TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基和2，4-D濃度對愈傷組織誘導的影響

共設計4組誘導培養(yǎng)基，包含2種類型基礎培養(yǎng)基和2種濃度2，4-D。試驗結(jié)果表明，同一激素濃度下，NB培養(yǎng)基的誘導率高于MS培養(yǎng)基的誘導率，即Y3>Y1，Y4>Y2，且愈傷組織狀態(tài)更好，無明顯根毛，芽較短。同一基礎培養(yǎng)基條件下，4和2 mg/L 2，4-D對愈傷誘導率差別不大。綜上，適宜的誘導培養(yǎng)基為Y3（ 4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D），誘導率為89.3%，且愈傷狀態(tài)良好（表3和圖1）。

2.2 不同濃度KT對愈傷組織分化再生的影響

設計了5種不同KT濃度分化培養(yǎng)基，金粳818愈傷組織在不同KT濃度分化培養(yǎng)基中分化成苗差異明顯。試驗數(shù)據(jù)表明，同一濃度NAA條件下，一定范圍內(nèi)KT濃度越高，分化率和成苗率越高，表現(xiàn)為F4>F3>F2>F1，KT濃度升高至6 mg/L，其分化率和成苗率反而有所下降。分化21 d時，F(xiàn)4處理綠點數(shù)量最多，個別愈傷組織分化出小苗（圖2）。因此，適宜分化培養(yǎng)基激素配比為F4處理，即5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，可使分化率和成苗率分別達到81.1%和52.1%（表4）。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定

提取24份再生幼苗基因組DNA作為模板，利用潮霉素基因特異引物進行PCR鑒定，結(jié)果表明，所有再生苗均為轉(zhuǎn)基因植株（圖3），農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化成功。

安徽農(nóng)業(yè)科學2022年

2.4 金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化完整過程

金粳818成熟胚誘導愈傷需10 d，愈傷繼代5 d，轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)3 d，篩選30 d，分化30 d，生根約7 d，整體遺傳轉(zhuǎn)化過程共計約85 d完成（圖4）。

3 結(jié)論與討論

影響水稻愈傷分化和再生的主要因素有基因型、外植體來源、培養(yǎng)基、激素等[8]。水稻基因型是控制愈傷組織誘導率和再生率的主要因素，有研究表明，粳稻的愈傷組織誘導率及分化率明顯優(yōu)于秈稻[9-11]。水稻常用的外植體有花藥、幼穗、幼胚及成熟胚，不同組織的愈傷誘導率和分化率不同，但由于花藥、幼穗、幼胚等外植體受到生長季節(jié)限制，取材不便，從而制約了其可用于遺傳轉(zhuǎn)化的數(shù)量，而成熟胚則不受限制[12-13]。劉書梅等[14]研究結(jié)果表明，MS和NB培養(yǎng)基分別更適合秈稻種胚愈傷和粳稻種胚愈傷的誘導培養(yǎng)，這與該研究結(jié)果一致，對金粳818而言，NB培養(yǎng)基誘導的愈傷狀態(tài)更好。激素種類、濃度和配比是影響愈傷組織誘導、分化再生的重要調(diào)控因子，其中2，4-D是誘導胚性愈傷組織必不可少的因子，該研究使用2 mg/L 2，4-D時，可達到較高誘導率;KT和6-BA是愈傷分化常用的細胞分裂素，沈秋平等[15]研究認為KT比6-BA分化效果要好。筆者研究了不同濃度KT對分化成苗率的影響，結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)KT濃度越高，分化成苗率越高。

綜上，該研究以金粳818成熟胚為外植體，設計4種激素配比不同的誘導培養(yǎng)基，將金粳818成熟胚外植體接種在誘導培養(yǎng)基中，10 d后觀察愈傷狀態(tài)并統(tǒng)計每組誘導率，得出適宜誘導培養(yǎng)基為4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D，誘導率為89.3%;設計5種激素配比不同的分化培養(yǎng)基，將金粳818愈傷組織接種后進行分化培養(yǎng)，統(tǒng)計每組分化率和成苗率，得出適宜分化培養(yǎng)基為MS+5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，其分化率和成苗率分別是81.1%和52.1%;整個遺傳轉(zhuǎn)化體系從誘導到幼苗再生共需要85 d。金稻818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，為利用生物技術手段定向改良品種奠定了技術基礎。

參考文獻

[1] 佟清越.粳型水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D].哈爾濱：黑龍江大學，2010.

[2] 彭小群，王夢龍.水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2021，37（27）：1-5.

[3] 毛建軍，楊秀芬，曾洪梅，等.水稻品種日本晴粳稻組培培養(yǎng)基的篩選及轉(zhuǎn)稻瘟菌蛋白激發(fā)子基因植株的獲得[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報，2008，16（5）：824-830.

[4] 何少海，姚盛存，豐宇凱，等.農(nóng)桿菌介導bar基因轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織的研究[J].浙江農(nóng)林大學學報，2017，34（1）：129-136.

[5] 曹含章，沈秋平，袁冰，等.3個粳稻品種成熟胚分化和再生適宜激素配比研究[J].雜交水稻，2020，35（4）：86-91.

[6] 李素娟，樊秀霞，王華，等.水稻不同品種組培再生和轉(zhuǎn)基因頻率研究[J].核農(nóng)學報，2013，27（12）：1817-1827.

[7] 張秀香.水稻成熟種子組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化及建立[J].安徽農(nóng)學通報，2012，18（12）：39-40，42.

[8] 朱克明，陶慧敏，徐碩，等.水稻愈傷分化和再生研究進展[J].種子，2016，35（11）：55-59.

[9] ABE T，F(xiàn)UTSUHARA Y.Genotypic variability for callus formation and plant regeneration in rice（Oryza sativa L.）[J].Theor Appl Genet，1986，72（1）：3-10.

[10] 王萍，徐大勇，王罡，等.粳秈稻兩個亞種成熟胚組織培養(yǎng)與再生能力的比較研究[J].種子，2007，26（10）：66-67.

[11] YAN J Q，XUE Q Z，ZHU J.Genetic studies of anther culture ability in rice（Oryza sativa）[J].Plant Cell Tissue Organ Cult，1996，45（3）：253-258.

[12] 王秀紅，史向遠，吳先軍.水稻不同外植體培養(yǎng)效果及其相關性分析[J].中國水稻科學，2005，19（2）：187-189.

[13] 鄭文靜，張燕之，王昌華，等.水稻不同外植體組織培養(yǎng)的差異性及其后代變異的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（4）：1368-1370.

[14] 劉書梅，王姍姍，辛曉云，等.不同培養(yǎng)基對水稻胚性愈傷組織誘導及分化的影響[J].生物學雜志，2011，28（4）：54-56.

[15] 沈秋平，嚴孫藝，薛宇彤，等.秈稻9311成熟胚高效再生體系的建立[J].雜交水稻，2019，34（2）：49-52.