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    直播稻金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

    2022-05-17 00:42:45李軍玲張紅磊張融雪蔡昱萌汪穎佟卉劉燕清蘇京平
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2022年9期
    關鍵詞:遺傳轉(zhuǎn)化愈傷組織

    李軍玲 張紅磊 張融雪 蔡昱萌 汪穎 佟卉 劉燕清 蘇京平

    摘要 [目的]建立高效的金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。[方法]以直播稻品種金粳818成熟胚為外植體,設計4種誘導培養(yǎng)基,篩選適合金粳818的誘導條件;設計5種分化培養(yǎng)基,篩選適合金粳818的分化條件;獲得的愈傷組織用農(nóng)桿菌介導法進行轉(zhuǎn)基因再生。[結(jié)果]最佳誘導培養(yǎng)基為4.10 g/L NB+2 mg/L 2,4-D,誘導率為89.3%;最佳分化培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA,分化率為81.1%,成苗率為52.1%;經(jīng)PCR分子檢測,再生幼苗100%為轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)論]該研究建立了金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系,為品種定向改良奠定了技術基礎。

    關鍵詞 金粳818;成熟胚;愈傷組織;遺傳轉(zhuǎn)化

    中圖分類號 S 511? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611(2022)09-0100-04

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.024

    開放科學(資源服務)標識碼(OSID):

    Establishment of Genetic Transformation System of Mature Embryo of Direct Seeding Japonica Rice Variety Jingeng 818

    LI Jun-ling, ZHANG Hong-lei, ZHANG Rong-xue et al

    (Crop Research Institute, Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Tianjin 300384)

    Abstract [Objective]To establish an efficient genetic transformation system of Jingeng 818. [Method]Using the mature embryo of direct seeding rice variety Jingeng 818 as explant, four induction medium schemes were designed to obtain the suitable induction conditions of Jingeng 818;five kinds of differentiation medium were designed to obtain the suitable differentiation condition for Jingeng 818; and the obtained callus was used to establish the transgenic regeneration system by agrobacterium mediated method. [Result]The results showed that the best induction medium was 4.10 g/L NB+2 mg/L 2,4-D with the induction rate 89.3%. The best differentiation medium was MS+5.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA with the differentiation rate 82.1% and the seedling rate 52.1%. By PCR molecular detection, 100% of the regenerated seedlings were transgenic positive plants.[Conclusion] In this study, the genetic transformation system of mature embryo of Jingeng 818 was established, which laid a technical foundation for directional improvement of varieties.

    Key words Jingeng 818;Mature embryo;Callus;Genetic transformation

    水稻是我國第一大口糧作物,水稻生產(chǎn)事關國家口糧安全。稻田雜草防除是生產(chǎn)中的棘手問題,由于禾本科雜草、雜草稻等與水稻親緣關系較近,常規(guī)除草劑對其無效,培育具有除草劑抗性水稻品種能較好地解決稻田草害問題。金粳818是天津市水稻研究所選育的具有除草劑抗性的粳型常規(guī)水稻品種,為采用生物技術手段對金粳818進行改良而培育的新種質(zhì),可為除草劑抗性水稻提供新材料,其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立尤為重要。

    利用愈傷組織再生體系進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化是最廣泛應用的方法之一,具有明顯優(yōu)點,如外植體來源廣泛、周期短、易于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化效率高等[1];農(nóng)桿菌介導法是水稻遺傳轉(zhuǎn)化首選方法,具有易操作、低拷貝、基因沉默少、遺傳穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢[2]。相比秈稻而言,粳稻愈傷誘導率和分化再生率較高,不少粳稻品種的組織培養(yǎng)再生體系已經(jīng)建立且轉(zhuǎn)基因體系成熟,如日本晴、中花11、秀水134等[3-7]。影響水稻愈傷組織誘導率、分化率和再生率的主要因素是基因型[8],而品種間基因型的差異導致尚缺乏統(tǒng)一的配方適合所有品種。筆者以成熟胚為外植體,設計了4種不同誘導培養(yǎng)基摸索適宜誘導條件,設計5種分化培養(yǎng)基,利用獲得的愈傷組織以農(nóng)桿菌介導法進行轉(zhuǎn)基因再生,建立高效的金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系,為利用生物技術定向改良奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    以天津市水稻研究所自主育成的金粳818成熟胚為外植體。含有pCAMBIA1301質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌由天津市農(nóng)作物遺傳育種重點實驗室保存。培養(yǎng)基NB(貨號N492)和MS(貨號M519)及激素均購自Phytotechnology。

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 誘導培養(yǎng)基?;A培養(yǎng)基+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+3.5 g/L 植物凝膠+2,4-D(表1),調(diào)節(jié)pH為5.8。

    1.2.2 篩選培養(yǎng)基。4.1 g/L NB+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+3.5 g/L? 植物凝膠+2 mg/L 2,4-D+40 μg/L潮霉素+400 μg/L青霉素,調(diào)節(jié)pH為5.8。

    1.2.3 分化培養(yǎng)基。4.43 g/L MS+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 山梨醇+30 g/L蔗糖+3.5 g/L 植物凝膠+30 μg/L潮霉素+300 μg/L青霉素+不同激素組合(表2),調(diào)節(jié)pH為5.8。

    1.2.4 生根培養(yǎng)基。2.215 g/L MS+30 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝膠+20 μg/L潮霉素+200 μg/L青霉素,調(diào)節(jié)pH為5.8。

    1.2.5 AAM侵染液。4.1 g/L NB+68 g/L蔗糖+36 g/L 葡萄糖+0.5 g/L水解酪蛋白+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L L-谷氨酰胺+177 mg/L L-精氨酸+7.5 mg/L甘氨酸+300 mg/L L-天冬氨酸+2.5 mg/L 2,4-D,調(diào)節(jié)pH為5.2,使用前加入0.5 mL濃度為20 mg/L乙酰丁香酮。

    1.3 方法

    1.3.1 金粳818成熟胚愈傷組織誘導。收取當年新的金粳818成熟種子,剝離穎殼,取適量倒入50 mL離心管中,75%乙醇消毒1 min,30%次氯酸鈉(有效氯3%)消毒15 min,無菌水沖洗5~6次,去除多余水分,倒入鋪有3層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中,無菌風吹干15 min。最后接種到誘導培養(yǎng)基中,每皿25~35粒種子,28 ℃暗培養(yǎng)10 d,在水稻幼芽和成熟胚之間長出淡黃色、結(jié)構致密的胚性愈傷組織,掐芽剝離出愈傷后放入新的誘導培養(yǎng)基上3~5 d即可進行轉(zhuǎn)化,誘導10 d后統(tǒng)計誘導率。

    誘導率=出愈傷的成熟胚數(shù)量/總成熟胚數(shù)量×100%

    1.3.2

    農(nóng)桿菌培養(yǎng)及浸染。將含有pCAMBIA1301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105在YEP(含25 mg/L卡那霉素)固體平板上劃線,28 ℃培養(yǎng)2 d。刮取平板上的農(nóng)桿菌至AAM浸染液中,調(diào)整菌體濃度至OD600值為0.3~0.5,獲得農(nóng)桿菌懸浮液。挑取足夠數(shù)量的愈傷組織放入無菌三角瓶中,加入農(nóng)桿菌懸浮液,室溫放置浸染20 min,并間隔晃動幾次,倒掉菌液,將愈傷組織放置無菌濾紙上吸去多余菌液,轉(zhuǎn)移至鋪有一層無菌濾紙的固體培養(yǎng)基上,26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。

    1.3.3 篩選培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后的愈傷組織,用無菌水清洗2次,用含有500 μg/mL羧芐青霉素的無菌水沖洗1次,吸去多余水分后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌濾紙上,晾干,轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng),28 ℃,暗培養(yǎng)30 d。

    1.3.4 分化再生。篩選30 d后,在原愈傷的底部可見顏色淡黃、結(jié)構致密、直徑1~2 mm的陽性愈傷長出,挑取陽性愈傷到分化培養(yǎng)基上進行分化再生,培養(yǎng)條件為28 ℃,16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。15~20 d統(tǒng)計分化率,25~35 d統(tǒng)計成苗率。

    分化率=分化的愈傷組織數(shù)量/總愈傷組織數(shù)量×100%

    成苗率=分化的幼苗數(shù)量/分化的愈傷組織數(shù)量×100%

    1.3.5 生根培養(yǎng)及馴化。分化出的幼苗長到2~3 cm有明顯根系時,轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上,培養(yǎng)條件28 ℃,16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。7~10 d后,幼苗長出大量側(cè)根,當小苗長至高10~15 cm時,打開蓋子在室外煉苗2~3 d,取出小苗后洗去根部培養(yǎng)基,移栽至土中。

    1.3.6 轉(zhuǎn)基因植株鑒定。CTAB法提取幼苗DNA,并用潮霉素基因引物檢測植株。

    hygF:ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC

    hygR:TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA

    2 結(jié)果與分析

    2.1 培養(yǎng)基和2,4-D濃度對愈傷組織誘導的影響

    共設計4組誘導培養(yǎng)基,包含2種類型基礎培養(yǎng)基和2種濃度2,4-D。試驗結(jié)果表明,同一激素濃度下,NB培養(yǎng)基的誘導率高于MS培養(yǎng)基的誘導率,即Y3>Y1,Y4>Y2,且愈傷組織狀態(tài)更好,無明顯根毛,芽較短。同一基礎培養(yǎng)基條件下,4和2 mg/L 2,4-D對愈傷誘導率差別不大。綜上,適宜的誘導培養(yǎng)基為Y3( 4.10 g/L NB+2 mg/L 2,4-D),誘導率為89.3%,且愈傷狀態(tài)良好(表3和圖1)。

    2.2 不同濃度KT對愈傷組織分化再生的影響

    設計了5種不同KT濃度分化培養(yǎng)基,金粳818愈傷組織在不同KT濃度分化培養(yǎng)基中分化成苗差異明顯。試驗數(shù)據(jù)表明,同一濃度NAA條件下,一定范圍內(nèi)KT濃度越高,分化率和成苗率越高,表現(xiàn)為F4>F3>F2>F1,KT濃度升高至6 mg/L,其分化率和成苗率反而有所下降。分化21 d時,F(xiàn)4處理綠點數(shù)量最多,個別愈傷組織分化出小苗(圖2)。因此,適宜分化培養(yǎng)基激素配比為F4處理,即5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA,可使分化率和成苗率分別達到81.1%和52.1%(表4)。

    2.3 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定

    提取24份再生幼苗基因組DNA作為模板,利用潮霉素基因特異引物進行PCR鑒定,結(jié)果表明,所有再生苗均為轉(zhuǎn)基因植株(圖3),農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化成功。

    安徽農(nóng)業(yè)科學2022年

    2.4 金粳818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化完整過程

    金粳818成熟胚誘導愈傷需10 d,愈傷繼代5 d,轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)3 d,篩選30 d,分化30 d,生根約7 d,整體遺傳轉(zhuǎn)化過程共計約85 d完成(圖4)。

    3 結(jié)論與討論

    影響水稻愈傷分化和再生的主要因素有基因型、外植體來源、培養(yǎng)基、激素等[8]。水稻基因型是控制愈傷組織誘導率和再生率的主要因素,有研究表明,粳稻的愈傷組織誘導率及分化率明顯優(yōu)于秈稻[9-11]。水稻常用的外植體有花藥、幼穗、幼胚及成熟胚,不同組織的愈傷誘導率和分化率不同,但由于花藥、幼穗、幼胚等外植體受到生長季節(jié)限制,取材不便,從而制約了其可用于遺傳轉(zhuǎn)化的數(shù)量,而成熟胚則不受限制[12-13]。劉書梅等[14]研究結(jié)果表明,MS和NB培養(yǎng)基分別更適合秈稻種胚愈傷和粳稻種胚愈傷的誘導培養(yǎng),這與該研究結(jié)果一致,對金粳818而言,NB培養(yǎng)基誘導的愈傷狀態(tài)更好。激素種類、濃度和配比是影響愈傷組織誘導、分化再生的重要調(diào)控因子,其中2,4-D是誘導胚性愈傷組織必不可少的因子,該研究使用2 mg/L 2,4-D時,可達到較高誘導率;KT和6-BA是愈傷分化常用的細胞分裂素,沈秋平等[15]研究認為KT比6-BA分化效果要好。筆者研究了不同濃度KT對分化成苗率的影響,結(jié)果表明,一定范圍內(nèi)KT濃度越高,分化成苗率越高。

    綜上,該研究以金粳818成熟胚為外植體,設計4種激素配比不同的誘導培養(yǎng)基,將金粳818成熟胚外植體接種在誘導培養(yǎng)基中,10 d后觀察愈傷狀態(tài)并統(tǒng)計每組誘導率,得出適宜誘導培養(yǎng)基為4.10 g/L NB+2 mg/L 2,4-D,誘導率為89.3%;設計5種激素配比不同的分化培養(yǎng)基,將金粳818愈傷組織接種后進行分化培養(yǎng),統(tǒng)計每組分化率和成苗率,得出適宜分化培養(yǎng)基為MS+5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA,其分化率和成苗率分別是81.1%和52.1%;整個遺傳轉(zhuǎn)化體系從誘導到幼苗再生共需要85 d。金稻818成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立,為利用生物技術手段定向改良品種奠定了技術基礎。

    參考文獻

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