仿生取向纖維的剛度變化對(duì)巨噬細(xì)胞極化特性的影響

沈 勇，易兵成，沈炎冰，唐 寒，周 璟，薛蘇桐，張彥中

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

各種血管疾病是導(dǎo)致全球死亡病例增多的重要原因之一[1]。采用組織工程化血管移植物(tissue engineered vascular grafts，TEVGs)被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)患病血管組織功能恢復(fù)的最有前景的替代方法[2-3]。然而，直徑在6 mm以下的小口徑TEVGs植入身體后存在因生物相容性不佳引起的通暢率低的問題[4]。巨噬細(xì)胞作為與植入生物材料相遇最早的一類先天免疫細(xì)胞，其通過極化成促炎(M1)或抗炎(M2)表型來決定植入物誘導(dǎo)組織再生的功效[5-6]。

基于靜電紡的仿生纖維在構(gòu)建TEVGs方面具有巨大潛力。采用靜電紡技術(shù)制備的納/微米超細(xì)纖維與天然組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中纖維組分的纖維細(xì)度類似，其高比表面積可為細(xì)胞黏附提供較多的結(jié)合位點(diǎn)，超細(xì)度帶來的力學(xué)柔順性可有效促進(jìn)細(xì)胞的重塑基質(zhì)作用[7-8]，因此非常適合用于軟組織工程。巨噬細(xì)胞在TEVGs植入后的早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，為了解這類仿生纖維對(duì)巨噬細(xì)胞表型和功能的影響，Saino等[9]將巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)在4種不同類型的靜電紡左旋聚乳酸(poly(L-lactic acid)，PLLA)纖維支架上，發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細(xì)胞分泌促炎分子主要取決于纖維直徑，且以納米纖維PLLA支架的炎癥反應(yīng)最小。Garg等[10]研究靜電紡支架的纖維直徑和孔徑大小對(duì)鼠骨髓源巨噬細(xì)胞向M2或M1極化的影響，結(jié)果顯示，與纖維直徑相比，支架的孔徑對(duì)巨噬細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)更為關(guān)鍵。Jia等[7]將鼠骨髓源巨噬細(xì)胞接種在取向和無紡聚(L-丙交酯-co-己內(nèi)酯)(poly(lactide-co-caprolactone，PLCL)支架上，發(fā)現(xiàn)取向納米纖維顯著引導(dǎo)巨噬細(xì)胞沿著纖維方向伸長(zhǎng)并向促再生表型發(fā)展，而無紡納米纖維引導(dǎo)促炎表型。這些研究雖然探索了靜電紡纖維支架的直徑、取向和孔尺寸等參數(shù)對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，但在靜電紡纖維剛度變化(尤其是具有結(jié)構(gòu)特異性的取向纖維)對(duì)巨噬細(xì)胞極化影響方面的研究還少有關(guān)注。

鑒于天然血管的各向異性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，筆者課題組前期研究了靜電紡取向纖維的表面拓?fù)涮卣鱗11]、生化信號(hào)修飾[12]及剛度變化對(duì)血管細(xì)胞行為的影響[13-14]。作為對(duì)前期研究工作的一個(gè)拓展，本文仍采用調(diào)整剛性PLLA芯層和彈性PLCL殼層的組成比例作為改變PLCL/PLLA殼芯纖維剛度的策略，通過筆者課題組研發(fā)的穩(wěn)定射流同軸靜電紡技術(shù)(SJCES)制備了仿生取向纖維PLCL/PLLA，然后研究其剛度變化對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞響應(yīng)行為(如形貌變化、增殖、遷移及極化等)的影響。

1 試驗(yàn)部分

1.1 PLCL/PLLA殼芯取向纖維的制備

以六氟異丙醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的PLCL(丙交酯與己內(nèi)酯質(zhì)量比為50∶50，黏度為IV 2.9 dL/g，濟(jì)南岱罡生物材料)殼層溶液和PLLA(Mw=100 000，濟(jì)南岱罡生物材料)芯層溶液。為消除靜電紡中的射流不穩(wěn)定鞭動(dòng)現(xiàn)象[15]，各紡絲溶液中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的超高相對(duì)分子質(zhì)量聚氧化乙烯(Mw>5 000 000，Alfa Aesar公司，英國(guó))。然后利用SJCES制備PLCL/PLLA殼芯結(jié)構(gòu)纖維[14]，紡絲參數(shù)：電壓為5～9 kV；接收距離為20 cm；滾筒直徑為10 cm；收集速度為1 000 r/min；溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為25%～30%。紡絲過程中通過同時(shí)調(diào)節(jié)PLCL殼層和PLLA芯層的注射速率(保持相同的總注射速率0.5 mL/h)，制備4種具有不同剛度的取向纖維基質(zhì)(AFSs)，即0.50、0(PLCL注射速率為0.5 mL/h，PLLA注射速率為0 mL/h，作為S1組，依此類推)，0.35、0.15(S2組)，0.20、0.30(S3組)，0.05、0.45(S4組)。將制備的纖維在真空中干燥2星期以完全去除溶劑。

1.2 取向纖維的表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi TM-1000型，日本)在5 kV加速電壓下觀察AFSs的形貌，在SEM拍攝之前對(duì)AFSs噴金60 s?；讷@得的SEM圖像，通過ImageJ軟件分析纖維直徑和纖維取向度。

采用拉伸力學(xué)法測(cè)試取向纖維的彈性模量。采用與PLCL/PLLA同樣的紡絲方法紡絲2 h制備取向纖維并剪成長(zhǎng)20 mm的短纖維束，然后在環(huán)境條件下，將短纖維束夾固在臺(tái)式拉力測(cè)試儀(HY-940FS型，上海)上進(jìn)行拉伸測(cè)試(n≥8)，所用的力傳感器容量為50 N，拉伸速率為10 mm/min。根據(jù)拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線計(jì)算彈性模量。

1.3 巨噬細(xì)胞對(duì)不同剛度取向纖維的響應(yīng)檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與材料處理

RAW 264.7巨噬細(xì)胞購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫，其完全培養(yǎng)基由體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素/鏈霉素和基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)基組成。在接種細(xì)胞之前，對(duì)AFSs進(jìn)行滅菌處理：紫外照射過夜，在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡2 h；用磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液清洗3次，每次5 min；浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)基中在37 ℃下孵育過夜。

1.3.2 細(xì)胞形貌

以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度將RAW 264.7接種于AFSs上，每孔加500 μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)1 d后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗一遍；加體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定細(xì)胞至少4 h，用PBS溶液清洗3次，每次3～5 min；然后用體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%及100%的乙醇分別進(jìn)行15 min以上梯度脫水；脫水后將樣品放入干燥箱中干燥；最后用SEM在8～10 kV的加速電壓下觀察細(xì)胞形貌。

以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度將RAW 264.7接種于AFSs上。培養(yǎng)1 d后用PBS溶液清洗并用質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，然后用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-100(Aldrich公司，美國(guó))通透細(xì)胞10 min。每孔用200 μL的Phalloidin(Invitrogen公司，美國(guó))染色20 min，用DAPI(Invitrogen公司，美國(guó))染細(xì)胞核10 min。最后，PBS溶液清洗后用倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-S型，Nikon公司，日本)觀察細(xì)胞形貌。用ImageJ軟件對(duì)染色圖片進(jìn)行細(xì)胞核取向度分析，如圖1所示。

圖1 細(xì)胞核取向度分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of cell nucleus orientation analysis

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將RAW 264.7以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在AFSs上后分別培養(yǎng)1和3 d，然后使用CCK-8(Beyotime公司，中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。檢測(cè)具體步驟：在指定的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，將原先的培養(yǎng)基替換為含有15 μL CCK-8溶液的300 μL新培養(yǎng)基，于37 ℃下孵育4 h，孵育結(jié)束后每孔取100 μL加到96孔板中，用酶標(biāo)儀(MK3型，Thermo公司，美國(guó))在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1.3.4 細(xì)胞遷移檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[14]中的細(xì)胞遷移方法，將中間有1 mm厚隔離橫杠的鋼環(huán)放置在24孔板中的AFSs上，然后將RAW 264.7以5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在AFSs上預(yù)制“人工傷口”。培養(yǎng)24 h后，去除鋼環(huán)使細(xì)胞在“傷口”區(qū)域自由遷移24 h。最后將細(xì)胞固定并用Phalloidin染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。根據(jù)拍攝的熒光圖片，用ImageJ軟件分析細(xì)胞集體遷移情況。按照式(1)計(jì)算細(xì)胞集體遷移速率。

(1)

式中：V為細(xì)胞集體遷移速率；H0為“人工傷口”的初始寬度；Sa為“人工傷口”的未愈合面積；L為拍攝圖片寬度。

1.3.5 基因表達(dá)分析

將RAW 264.7以1×106個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在6孔板里的AFSs上，培養(yǎng)1和3 d，然后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)過程：采用總RNA提取試劑盒(天根公司，中國(guó))從細(xì)胞中提取RNA；再用FastKing RT Kit試劑盒(天根公司，中國(guó))將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；最后使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒(天根公司，中國(guó))根據(jù)其使用說明配制反應(yīng)體系，并用ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)基因表達(dá)情況。引物序列如表1所示，對(duì)所有檢測(cè)基因均基于Gapdh進(jìn)行歸一化處理。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.6 蛋白表達(dá)分析

ELISA檢測(cè)：樣本孔加待測(cè)樣本10 μL，再加稀釋液40 μL(即樣本稀釋5倍)，空白孔不加樣本；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封孔后于37 ℃下溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃下避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度。

免疫熒光染色：將支架用PBS清洗3次后再用質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的多聚甲醛固定30 min，用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-100通透10 min后，用體積分?jǐn)?shù)為10%的山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)30 min；將小鼠單克隆抗小鼠CD206抗體(1∶100稀釋比，Proteintech公司，中國(guó))和兔多克隆抗小鼠INOS抗體(1∶400稀釋比，Abcam公司，英國(guó))在4 ℃條件下孵育過夜；在室溫下加入CD206山羊抗小鼠IgG二抗 (1∶100稀釋比，Abcam公司，英國(guó))或INOS山羊抗兔IgG二抗(1∶100稀釋比，Abcam公司，英國(guó))孵育90 min，然后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色；最后用激光共聚焦掃描顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))觀察表型蛋白的表達(dá)情況。

測(cè)量細(xì)胞熒光強(qiáng)度：基于ImageJ軟件，使用“任意繪圖/選擇工具”選擇要測(cè)量的細(xì)胞；從分析菜單中選擇“設(shè)置測(cè)量”，確保選擇了面積、累積光密度和平均灰度值(其余部分可忽略)；從分析菜單中選擇“測(cè)量”，可以看到一個(gè)彈出框，其中包含第一個(gè)細(xì)胞的值；選擇單元格旁無熒光的區(qū)域?yàn)楸尘?；?duì)視場(chǎng)中要測(cè)量的其他細(xì)胞重復(fù)此步驟；完成后，選擇結(jié)果窗口中的所有數(shù)據(jù)，然后復(fù)制到新Excel工作表(或類似程序)中；使用式(2)計(jì)算校正后的單細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

(2)

式中：A為單細(xì)胞熒光強(qiáng)度；I為細(xì)胞總熒光強(qiáng)度；Sc為選定細(xì)胞面積；F為背景讀數(shù)的平均熒光強(qiáng)度；N為細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。統(tǒng)計(jì)圖的制作和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用Origin 8.0軟件。組間比較選擇方差分析(One way ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析。*p<0.05時(shí)為有顯著性差異；**p<0.01時(shí)為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFSs的制備與表征

根據(jù)文獻(xiàn)[14]，通過SJCES法可成功制備高度取向的PLCL/PLLA復(fù)合纖維，如圖2(a)所示。在紡絲過程中通過調(diào)控殼、芯紡絲液注射速率獲得的S1～S4組復(fù)合纖維的平均直徑,分別為(1.56±0.13)、(1.45±0.13)、(1.47±0.12)及(1.38±0.14)μm，各組間的纖維細(xì)度無顯著差異。此外，從量化的纖維取向度來看，S1～S4組的纖維取向度分別為0°±2.52°、0°±1.82°、0°±1.45°及0°±1.71°，均具有極高的取向度(見圖2(b))。

圖2(c)為各組取向纖維典型的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線。在PLCL/PLLA復(fù)合纖維中，當(dāng)逐漸增大剛性成分PLLA的比例使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0增加到90%時(shí)，不僅纖維的拉伸強(qiáng)度得到顯著提高，復(fù)合纖維的彈性模量也從(18.05 ± 1.52)MPa增加到(951.92 ± 41.83)MPa，如圖2(d)所示，提高至近53倍；但是剛性PLLA的引入降低了PLCL/PLLA取向纖維的斷裂伸長(zhǎng)率，從純PLCL的280%(S1)降低到PLLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%時(shí)(S4)的60%，如圖2(c)所示。這些結(jié)果說明通過制備殼芯結(jié)構(gòu)纖維實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合纖維剛度調(diào)控的可行性。由于采用殼芯纖維結(jié)構(gòu)來調(diào)控纖維剛度，這將排除前人工作中因調(diào)控剛度參數(shù)帶來的支架表面的化學(xué)組成和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的干擾[16]，從而為此類研究提供了一種理想的平臺(tái)。

圖2 通過SJCES制備的不同PLCL/PLLA纖維的表征Fig.2 Characterization of the different PLCL/PLLA fibers produced by SJCES

2.2 AFSs剛度對(duì)巨噬細(xì)胞表觀行為的影響

采用SEM和細(xì)胞骨架染色兩種方法首先探究了AFSs的剛度變化對(duì)RAW 264.7細(xì)胞形貌的影響，如圖3(a)和(b)所示。SEM結(jié)果顯示，最柔軟的S1組上的細(xì)胞接近紡錘形，立體凸起狀明顯，幾乎沒有鋪展，且紡錘兩端與纖維方向一致。隨著AFSs剛度的增加，細(xì)胞逐漸鋪展開來且扁平化。從熒光染色結(jié)果看，在S1組上能觀察到細(xì)胞骨架沿纖維方向取向的細(xì)胞形態(tài)，而S2～S4組的細(xì)胞具有更明顯的沿取向纖維方向延伸和鋪展的形貌，說明取向纖維對(duì)細(xì)胞的接觸誘導(dǎo)作用，這些結(jié)果與文獻(xiàn)[17]探索基質(zhì)剛度影響的研究一致。AFSs剛度對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的遷移也有明顯影響，如圖3(c)所示，細(xì)胞沿纖維方向的遷移速率隨基質(zhì)剛度的增加而增加。

圖3 RAW 264.7細(xì)胞在不同剛度AFSs上的形貌和遷移Fig.3 Morphology and migration of RAW 264.7 cells on AFSs with varying stiffness

根據(jù)熒光染色圖片，對(duì)細(xì)胞黏附鋪展和取向進(jìn)行定量測(cè)試的結(jié)果表明：S1組上的細(xì)胞鋪展面積最小，與其他3組有顯著性差異；S2～S4組上的細(xì)胞鋪展面積接近，組間無顯著性差異，如圖4(a)所示。

在取向度方面，不同剛度AFSs的細(xì)胞核取向相似，即細(xì)胞沿取向纖維方向延伸，不受纖維剛度的影響，如圖4(b)所示。細(xì)胞遷移定量測(cè)試結(jié)果顯示接種在最軟的S1組上的巨噬細(xì)胞具有最低的遷移速率(5.12±0.24)μm/h，而在S4基質(zhì)上的細(xì)胞遷移速率高達(dá)(10.42±0.54)μm/h，如圖4(c)所示。巨噬細(xì)胞的遷移功能在炎癥反應(yīng)中必不可少[18]，與其及時(shí)到達(dá)發(fā)炎區(qū)域發(fā)揮防御功能密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞遷移受損將導(dǎo)致多種疾病和自身免疫疾病。然而，目前尚無關(guān)于剛度對(duì)巨噬細(xì)胞遷移影響的共識(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的遷移速率與基質(zhì)剛度呈正相關(guān)關(guān)系，這與文獻(xiàn)[19]的研究結(jié)果一致。RAW 264.7細(xì)胞增殖也受AFSs剛度影響，總體上在培養(yǎng)1和3 d后的巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量與AFSs纖維的剛度也呈正相關(guān)，即剛度較大的纖維基質(zhì)更利于促進(jìn)細(xì)胞的增殖，如圖4(d)所示。文獻(xiàn)[20-22]研究表明多種細(xì)胞類型(如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等)在高剛度基質(zhì)上具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力，本研究的RAW 264.7細(xì)胞在不同剛度取向纖維上的增殖結(jié)果支持這一結(jié)論。

圖4 RAW 264.7細(xì)胞在不同剛度AFSs上的鋪展面積、細(xì)胞核取向度、遷移速率和增殖Fig.4 Spreading area,nuclear orientation,migration rate and proliferation of RAW 264.7 cells on AFSs with varying stiffness

近年來，基質(zhì)剛度已被證明對(duì)細(xì)胞的黏附、收縮、遷移和分化等行為是至關(guān)重要的。Vatankhah等[23]制備了不同剛度的無紡纖維，研究發(fā)現(xiàn)低剛度的無紡纖維雖不利于細(xì)胞黏附，但卻更能維持平滑肌細(xì)胞的收縮表型，由此證實(shí)支架剛度是比生物信號(hào)更能影響平滑肌細(xì)胞功能的重要因素。Merkle等[24]采用調(diào)控不同組分的比例來制備不同剛度無紡纖維的方法，研究了纖維剛度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞行為的影響，結(jié)果證實(shí)纖維剛度的提高能促進(jìn)細(xì)胞的黏附，也能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。這些研究表明特定細(xì)胞類型的細(xì)胞行為對(duì)基質(zhì)剛度的高度依賴性，不僅如此，組織病變?nèi)绨┌Y和動(dòng)脈粥樣硬化也與基質(zhì)剛度的變化密切相關(guān)[25]。因此，研究巨噬細(xì)胞對(duì)纖維基質(zhì)剛度變化的響應(yīng)行為將是對(duì)這一領(lǐng)域的重要補(bǔ)充和豐富，并體現(xiàn)出一定的在細(xì)胞表觀響應(yīng)行為趨勢(shì)上的一致性。

2.3 AFSs剛度對(duì)巨噬細(xì)胞的極化特性的影響

使用qRT-PCR技術(shù)在基因水平檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1相關(guān)基因(Tnf-α,Il-1β,Il-6,Mcp-1)和M2相關(guān)基因(Tgf-β,Il-10,Cd206)的表達(dá)情況，如圖5所示。由圖5(a)和(b)可知：培養(yǎng)1 d后M1表型相關(guān)基因中Il-1β和Il-6的表達(dá)無顯著性差異；Tnf-α在S1組表達(dá)較少且僅與S4組有顯著性差異；Mcp-1的表達(dá)總體上隨著基質(zhì)剛度的增加而增加。M2表型相關(guān)基因中Il-10在不同組的表達(dá)接近，組間無顯著性差異；Tgf-β在S2組表達(dá)最多，且僅在S2組和S1組之間有差異；Cd206在S1組表達(dá)最多，與其他組間均有顯著性差異。這些結(jié)果說明取向纖維的剛度性質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)(1 d)對(duì)巨噬細(xì)胞極性的影響還比較有限。由圖5(c)和(d)可知：培養(yǎng)3 d后M1表型相關(guān)基因中，Il-1β的表達(dá)仍無顯著性差異；Tnf-α在S2組表達(dá)最少，卻在S1和S3組表達(dá)較多；Il-6和Mcp-1的表達(dá)與基質(zhì)剛度呈正相關(guān)。M2表型相關(guān)基因中，Tgf-β在S2組表達(dá)最多，在S1組表達(dá)最少；Il-10和Cd206的表達(dá)與基質(zhì)剛度呈負(fù)相關(guān)。這些基因水平結(jié)果表明，培養(yǎng)3 d后剛度較低的纖維基質(zhì)(S1、S2組)傾向于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型發(fā)展。

圖5 RAW 264.7細(xì)胞在不同剛度AFSs上培養(yǎng)1和3 d后M1相關(guān)基因和M2相關(guān)基因的表達(dá)情況(n≥3)Fig.5 The expression of M1-related genes and M2-related genes of RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness for 1 day and 3 days (n≥3)

進(jìn)一步采用ELISA和免疫熒光染色在蛋白水平評(píng)估AFSs剛度對(duì)巨噬細(xì)胞極化特性的影響。圖6為細(xì)胞培養(yǎng)1和3 d后ELISA檢測(cè)M1相關(guān)細(xì)胞因子(TNF-α,IL-1β)和M2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-10,TGF-β)的表達(dá)情況。由圖6(a)可知，培養(yǎng)1 d，取向纖維的剛度變化對(duì)M1相關(guān)細(xì)胞因子(TNF-α,IL-1β)和M2相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)影響不明顯，只有IL-10在S1和S4組的表達(dá)有顯著性差異，IL-10在S1組的表達(dá)最多。由圖6(b)可知：培養(yǎng)3 d，M1相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)仍然無顯著性差異，而TNF-α的表達(dá)大體上與纖維剛度呈正相關(guān)；M2相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)大體上與纖維剛度負(fù)相關(guān)，TGF-β在S2～S4組的表達(dá)較多，在S1組的表達(dá)最少。

圖6 RAW 264.7細(xì)胞在不同剛度AFSs上的蛋白表達(dá)(n ≥ 3)Fig.6 Protein expression of the RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness (n≥3)

選擇INOS和CD206分別作為M1和M2表型標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖7所示。可以比較直觀地看到：INOS的熒光強(qiáng)度在S2組較高，即INOS在S2組表達(dá)較多；CD206的熒光強(qiáng)度在S1組較高，即CD206在S1組表達(dá)較多。

圖7 不同剛度AFSs上RAW 264.7細(xì)胞INOS和CD206的免疫熒光染色Fig.7 Immunofluorescence staining of INOS and CD206 in RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness

熒光定量分析結(jié)果表明：INOS的表達(dá)在S2組中最多，而在S4組中最少，如圖8(a)所示；CD206的表達(dá)隨基質(zhì)剛度的增加而降低，即在S1組中表達(dá)最多，在S4組中表達(dá)最少，如圖8(b)所示。

圖8 不同剛度AFSs上RAW 264.7細(xì)胞INOS和CD206的定量表達(dá)(n≥3)Fig.8 Quantitative expression of INOS and CD206 in RAW 264.7 cells cultured on AFSs with varying stiffness (n ≥ 3)

根據(jù)第1 d的ELISA結(jié)果，不同剛度組AFSs之間的細(xì)胞因子分泌基本沒有差異，只有抗炎因子IL-10在S1組中表達(dá)最多，并與S4組有差異，如圖6(a)所示。但在第3 d可以明顯看到除促炎因子IL-1β外其他3種細(xì)胞因子分泌量的差異，這暗示了力學(xué)信號(hào)(如剛度)作用的時(shí)間依賴性。無論在第1 d還是第3 d，不同AFSs上IL-1β的分泌都沒有差異，因此推測(cè)IL-1β的分泌不受取向纖維的剛度調(diào)節(jié)，或者可以影響其表達(dá)的剛度不在本研究中用到的AFSs的剛度范圍。培養(yǎng)1 d后M1促炎標(biāo)志物TNF-α和IL-1β在不同組無顯著性差異，而INOS在S2、S3組分泌較多，S1和S4組分泌較少，在本研究剛度范圍內(nèi)不呈線性表達(dá)，可能是S2和S3剛度范圍較有利于INOS的表達(dá)。根據(jù)文獻(xiàn)[17]研究的剛度范圍為130～840 kPa的水凝膠基質(zhì)對(duì)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞表型極化的影響，可知在沒有可溶性共刺激物的情況下剛度變化不會(huì)帶來顯著影響。Irwin等[26]發(fā)現(xiàn)TNF-α在不同剛度基質(zhì)上的分泌無明顯差異，與TNF-α相比，IL-8的分泌呈雙相性，在1.4和348.0 kPa基質(zhì)上分泌較低，而在10.0 kPa基質(zhì)上分泌較高?；|(zhì)剛度對(duì)巨噬細(xì)胞黏附和激活的影響仍有爭(zhēng)議，目前未有一致的結(jié)論。

總體來看，研究結(jié)果表明AFSs基質(zhì)剛度對(duì)巨噬細(xì)胞具有深遠(yuǎn)的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，軟基質(zhì)(如S1組)使巨噬細(xì)胞偏向M2表型，硬基質(zhì)(如S4組)使巨噬細(xì)胞偏向M1表型。對(duì)組織微環(huán)境力學(xué)線索(如剛度)的深度理解將有助于設(shè)計(jì)能夠改善組織重塑與再生的仿生纖維生物材料，促進(jìn)仿生組織工程化血管的再生。

3 結(jié) 語

本研究將RAW 264.7細(xì)胞接種到不同剛度的AFSs上培養(yǎng)，通過SEM、熒光染色、CCK-8、ELISA、qRT-PCR等試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AFSs的剛度會(huì)影響巨噬細(xì)胞的響應(yīng)行為。在細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，與軟質(zhì)纖維基質(zhì)相比，硬質(zhì)纖維基質(zhì)更傾向于將巨噬細(xì)胞向促炎表型引導(dǎo)。巨噬細(xì)胞的表型功能對(duì)靜電紡仿生纖維的剛度具有高度的依賴性，研究結(jié)果可對(duì)未來設(shè)計(jì)有效的仿生纖維基TEVGs提供指導(dǎo)和借鑒。