西馬特羅單克隆抗體的制備及膠體金快速檢測(cè)卡的研發(fā)

劉穎沙 劉昭彤 曹亞岐 魯瑤 岳彩洋 任若春

摘要：在國家糧食安全戰(zhàn)略下，瘦肉精對(duì)人們健康造成很大威脅和沖擊，目前市面上三聯(lián)卡較多，對(duì)于鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種類型的瘦肉精研究較多。通過制備西馬特羅單克隆抗體，優(yōu)化膠體金標(biāo)記及C、T線包被條件，制備能夠快速檢測(cè)豬肉中的西馬特羅殘留量的膠體金快速檢測(cè)卡。結(jié)果表明，單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 ku，染色體數(shù)目為83～91 條，親和常數(shù)為2.51×108 mol/L，最適pH值為7.5，最佳抗體標(biāo)記量為6 μL/mL，最佳離心條件為8 000 r/min，T線最適包被濃度為1.0 mg/mL，C線包被濃度為0.5 mg/mL，對(duì)西馬特羅的檢測(cè)限（靈敏度）為10 ng/mL，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅無交叉反應(yīng)，特異性好。與酶聯(lián)免疫吸附法的20份樣品符合率良好，提示新研發(fā)的檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，可在屠宰、養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中完成豬肉西馬特羅的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：西馬特羅;單克隆抗體;瘦肉精;豬肉;快速檢測(cè)卡

中圖分類號(hào)：TS251.7 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0182-05

瘦肉精，可提高動(dòng)物瘦肉率，抑制肥肉生長[1-3]。對(duì)于瘦肉精的快速檢測(cè)，科研工作研發(fā)快速檢測(cè)卡、試劑盒等[4]，柳海燕等研制成功可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)二聯(lián)速測(cè)紙條，可測(cè)定2項(xiàng)瘦肉精[5]。任清丹等對(duì)三聯(lián)速測(cè)卡準(zhǔn)確度優(yōu)化提出改進(jìn)措施，提供技術(shù)攻關(guān)[6]。喻俊磊等對(duì)動(dòng)物源性食品中3項(xiàng)瘦肉精檢測(cè)卡進(jìn)行穩(wěn)健性評(píng)價(jià)，采用評(píng)價(jià)測(cè)試法[7]。對(duì)于鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種類型的瘦肉精研究較多[8-11]。

西馬特羅，能促進(jìn)腺苷酸環(huán)化酶的合成，從而降低脂肪合成率，增加肌肉中的蛋白質(zhì)[12]。其與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等10余種物質(zhì)類似，俗稱均為瘦肉精[13-14]。

在國家糧食安全的戰(zhàn)略下，瘦肉精對(duì)人們的健康造成了很大的威脅和沖擊，人們對(duì)于食品安全的意識(shí)逐步加強(qiáng)，科研工作者研發(fā)相關(guān)的檢測(cè)方法。對(duì)于西馬特羅，目前主要采用高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法及新興的酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，但是對(duì)于更加快速的膠體金免疫層析法文獻(xiàn)較少，因此本研究通過制備西馬特羅單克隆抗體，優(yōu)化膠體金標(biāo)記以及CT線包被條件，制備能夠快速檢測(cè)豬肉中西馬特羅殘留量的膠體金快速檢測(cè)卡。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020—2021年在陜西楊凌進(jìn)行研制西馬特羅，豬肉組織樣品、尿樣，采自楊凌家香牧業(yè)有限公司。

西馬標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%）、鹽酸克倫特羅-瘦肉精（98.8%）、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品、妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%），購自于壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;氯化金、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸、Tween-20購自于西安企鵝生物科技有限公司;牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）購自于Sigma;Tris-HCl、羊抗兔 IgG、吸水紙、硝酸纖維素膜（NC膜）、結(jié)合墊、樣品墊購自于上海捷寧生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純購自于楊凌三力化玻站。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，購自于上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;劃膜噴金儀購自于上海捷寧生物科技有限公司;可編程切條機(jī)，購自于上海捷寧生物科技有限公司;酶標(biāo)儀，購自于美國伯樂公司;分析天平（萬分之一），購自于梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司;分光光度計(jì)購，自于上海天普分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 西馬特羅單克隆抗體制備

1.3.1.1 人工抗原的合成

西馬特羅含有芳伯氨基，在強(qiáng)酸和冷卻條件下芳伯氨基可以生成親電的重氮鹽，與蛋白中的給電子基團(tuán)如酪氨酸、組氨酸殘基反應(yīng)，生成偶氮產(chǎn)物，制備成具有良好免疫原性。本研究采用西馬特羅作為半抗原與載體蛋白（HSA、BSA、OVA等）偶聯(lián)制備人工抗原[12]。

將西馬特羅、載體蛋白及兩者結(jié)合物配制成一定濃度的溶液，然后采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，經(jīng)過計(jì)算分析得到人工抗原的結(jié)合比和濃度。

CIM-BSA、CIM-HSA、CIM-OVA結(jié)合比分別為10 ∶1、15 ∶1、7 ∶1，濃度分別5.5、6.8、3.2 mg/mL。

1.3.1.2 抗體的制備 （1）動(dòng)物免疫。以CIM-BSA作為免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠。免疫時(shí)間一般需要間隔2周[15]。（2）單克隆抗體的制備。3免后第7天，采血清測(cè)效價(jià)，并分離陽性血清作對(duì)照[16]。

無菌操作取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合（比例數(shù)10 ∶1）。待細(xì)胞長至孔底的1/2～1/3時(shí)，采用已建立的ELISA方法篩選，最終得到3株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞[17]，編號(hào)為1A-4H-5G、3B-5G-3H、6B-3D-3H。

1.3.2 標(biāo)記條件優(yōu)化

1.3.2.1 pH值條件優(yōu)化

取6個(gè)1.5 mL的離心管，取1.0 mL膠體金溶液加入到離心管中，使每個(gè)離心管的pH值依次為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，搖勻，分別加入5 μL克倫特羅單克隆抗體，5～10 min 后再加入20%BSA溶液20 μL，放置5～10 min 后進(jìn)行離心（8 000 r/min，10 min），棄上清，加入200 μL復(fù)溶液重懸，通過試紙條上T線的顯色程度確定最佳pH值。

1.3.2.2 抗體標(biāo)記量條件優(yōu)化

取7個(gè)1.5 mL 離心管，取1.0 mL膠體金溶液加入到離心管中，將pH值調(diào)節(jié)至7.5，分別在每個(gè)離心管中加入1、3、5、10、20、40 μL西馬特羅單克隆抗體，5～10 min后再加入20% BSA溶液20 μL，放置5～10 min后進(jìn)行離心（8 000 r/min，10 min），棄上清，加入200 μL復(fù)溶液重懸。最佳標(biāo)記量為最小標(biāo)記量的1.2倍，最小標(biāo)記量是抗體加入量最小的情況下檢測(cè)線抑制效果佳。

1.3.2.3 離心力優(yōu)化

取7個(gè)1.5 mL的離心管，取1.0 mL膠體金溶液加入到離心管中，將pH值調(diào)節(jié)至7.5，分別在每個(gè)離心管中加入12 μL西馬特羅單克隆抗體，搖勻后，靜止5～10 min，再加入20% BSA溶液20 μL，分別于3 000、5 000、8 000、12 000 r/min 離心8 min，離心完后看上清液是否澄清及探針是否容易重懸。

1.3.3 免疫層析墊點(diǎn)樣濃度的確定

1.3.3.1 T線點(diǎn)樣濃度的確定

將包被西馬特羅抗原稀釋成0.5、0.8、1.0 mg/mL，包被至NC膜上，根據(jù)T線陰性顯色選擇及檢測(cè)限選擇最適T線包被濃度。

1.3.3.2 C線點(diǎn)樣濃度的確定

將二抗?jié)舛认♂尦?.5、1.0、1.5 mg/mL，包被至NC膜上，根據(jù)C線與T線陰性顯色選擇最適C線包被濃度。

1.3.4 膠體金快速檢測(cè)西馬特羅方法建立

1.3.4.1 標(biāo)記膠體金

調(diào)整10 mL膠體金的pH值（稍高于最佳）和抗體濃度（最佳），低溫?cái)嚢璩浞址磻?yīng)0.5 h，添加10%的20 μL/mL BSA封閉 15 min，分裝成10個(gè)1.5 mL小離心管，在最佳轉(zhuǎn)速和時(shí)間條件下離心，使金標(biāo)蛋白沉淀于底部，舍去上清液，將金標(biāo)蛋白沉淀用膠體金復(fù)溶液溶解，調(diào)整鋪金濃度，得到金標(biāo)抗體溶液。在玻璃纖維素膜上進(jìn)行噴涂，冷凍干燥后制作成為金標(biāo)墊。

1.3.4.2 NC膜T線和C線的包被

西馬特羅抗原稀釋調(diào)整濃度為最佳顯色濃度，并包被于NC膜的T線位置，即檢測(cè)線（T線）;羊抗鼠IgG抗體稀釋調(diào)整濃度為最佳顯色濃度，并包被于NC膜的C線位置，即質(zhì)控線（C線），形成免疫NC膜。再進(jìn)行干燥處理，其中干燥溫度為37 ℃，干燥時(shí)間為30～50 min，接著在封閉液中封閉，最后干燥即可。

1.3.4.3 樣品墊

樣品墊的前處理是需要玻璃纖維素膜浸沒入封閉液進(jìn)行封閉，再干燥即可。

1.3.4.4 吸水墊

吸水墊一般為普通的濾紙材料。

1.3.5 速測(cè)卡的組裝

在底板上從左到右依次為樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜以及吸水墊，最下層為NC膜，NC膜左側(cè)1.0 mm上壓金標(biāo)墊，在NC膜右側(cè)1.0 mm處上壓吸水墊，在金標(biāo)墊1.0 mm處上壓樣品墊，裁剪成3.5 mm寬的試紙條，裝于塑料卡殼內(nèi)，完成速測(cè)卡的組裝。加樣只需要吸取樣品3滴（100 μL）加入樣品孔中即可。

1.3.6 速測(cè)卡的性能檢測(cè)

將100 μL待檢樣品逐滴加入速測(cè)卡的樣品孔內(nèi)，待10 min觀察T線和C線的顯色狀態(tài)，記錄現(xiàn)象和顯色所需時(shí)間。

1.3.6.1 特異性試驗(yàn)

取西馬特羅相似物鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和妥布特羅，分別用甲醇溶解，再用PBS緩沖液稀釋成濃度為5、10、15、20、40、100 ng/mL 的溶液，采用空白溶液作為陰性對(duì)照，觀察不同類似物在試紙條上的顯色情況，采用速測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，觀察現(xiàn)象并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.6.2 靈敏性試驗(yàn)

取西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品，先用甲醇溶解，配制成濃度為10 μg/mL的溶液;然后用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度（5、10、15、20、40、100 ng/mL）的溶液，同時(shí)制備陰性對(duì)照。本測(cè)試卡為競(jìng)爭抑制原理設(shè)計(jì)而成，隨著濃度變大，T線顯色變淺，C線變深。因此，視覺極限檢測(cè)限（LOD）即為T線不顯色而C線顯色明顯的濃度值。

1.3.6.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用膠體金法和ELISA法進(jìn)行實(shí)際豬肉20份樣品檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行時(shí)間和效果比對(duì)，確定可行性和檢測(cè)效果的精準(zhǔn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 西馬特羅單抗的制備以及效價(jià)檢測(cè)結(jié)果分析

2.1.1 單克隆抗體的鑒定

經(jīng)間接ELISA檢測(cè)、染色體計(jì)數(shù)、SDS-PAGE電泳和ELISA單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，表明單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 ku，染色體數(shù)目為83～91條，親和常數(shù)為2.51×108 L/mol。

2.1.2 抗體的交叉反應(yīng)率

選擇與西馬特羅類似結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)替代西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IC50抑制濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體對(duì)西馬特羅的交叉反應(yīng)為100%，對(duì)沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率為8%，對(duì)妥布特羅的交叉反應(yīng)率為15%，對(duì)克侖特羅的交叉反應(yīng)率為10%，對(duì)氯丙那林和特布他林的交叉反應(yīng)分別為5%與4%，對(duì)萊克多巴胺、非諾特羅、噴布特羅、克侖巴胺、氧烯洛爾、異丙腎上腺素、腎上腺素和去甲腎上腺素的交叉反應(yīng)均<0.1%。

選擇與克倫特羅類似結(jié)構(gòu)或功能的藥物替代克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IC50抑制濃度，計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表1。

2.2 標(biāo)記條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 pH值條件優(yōu)化結(jié)果

由圖1可知，根據(jù)膠體金標(biāo)記的原理，在pH值接近和稍高于蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，膠體金蛋白吸附力最強(qiáng);pH值過高或過低均不利于兩者結(jié)合，當(dāng)pH值為7.5時(shí)，T線顯色最深，所以最適pH值為7.5。

2.2.2 抗體標(biāo)記量條件優(yōu)化結(jié)果 由表2可知，膠體金標(biāo)記的2個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是標(biāo)記時(shí)pH值和最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量的確定。當(dāng)抗體標(biāo)記量在5 μL/mL時(shí)，陰性T線顯色及檢測(cè)限顯色梯度最大;當(dāng)抗體標(biāo)記量為10 μL/mL時(shí)，陰性雖然顯色更深，但是檢測(cè)限抑制也會(huì)變差;當(dāng)抗體標(biāo)記量大于10 μL/mL時(shí)，陰性顯色會(huì)變淺，并且檢測(cè)限抑制也比較差，所以最佳抗體標(biāo)記量為5 μL/mL的120%，即為6 μL/mL。

2.2.3 離心條件優(yōu)化結(jié)果

當(dāng)轉(zhuǎn)速為3 000、5 000 r/min 時(shí)，上清液渾濁，說明轉(zhuǎn)速不夠，還有一部分膠體金沒有離心下來。當(dāng)轉(zhuǎn)速為8 000、12 000 r/min 時(shí)，上清液澄清，但轉(zhuǎn)速為 12 000 r/min 時(shí)探針不容易重懸，說明最佳轉(zhuǎn)速為 8 000 r/min。

2.3 NC膜包被條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 T線

由T線包被濃度顯色結(jié)果（表3）可知，隨著包被抗原濃度的增加，T線顯色變強(qiáng)，當(dāng)抗原包被濃度為1.0 mg/mL時(shí)，T線陰性顯色及檢測(cè)限顯色差異最大，所以T線最適包被濃度為 1.0 mg/mL。

2.3.2 C線

由C線包被濃度顯色結(jié)果（表4）可知，隨著二抗包被濃度的增加，C線顯色變強(qiáng)，當(dāng)二抗包被濃度為0.5 mg/mL時(shí)，C/T線顯色基本一致，所以C線最適包被濃度為0.5 mg/mL。

2.4 卡片應(yīng)用性檢測(cè)

2.4.1 靈敏度檢測(cè)

由圖2和表5可知，西馬特羅檢測(cè)卡在5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，T線顯色略微有影，10 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，T線不顯色，說明西馬特羅檢測(cè)卡的靈敏度為10 ng/mL。

2.4.2 特異性檢測(cè)

由圖3和表6可知，添加不同濃度的鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)西馬特羅檢測(cè)卡均未發(fā)生抑制作用，說明西馬特羅檢測(cè)卡與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅無交叉反應(yīng)，特異性好。

2.4.3 準(zhǔn)確度檢測(cè)

由準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果（表7）可知， 研制的西馬特羅檢測(cè)卡與酶聯(lián)免疫吸附法的20份樣品符合率良好。

3 結(jié)論

在國家糧食安全的戰(zhàn)略下，瘦肉精對(duì)人們健康造成了很大的威脅和沖擊，市面上對(duì)于西馬特羅的快速檢測(cè)方法研究較少。本研究通過制備西馬特羅單克隆抗體，探索發(fā)現(xiàn)最適pH值為7.5，最佳抗體標(biāo)記量為6 μL/mL，最佳離心條件為8 000 r/min，得出T線最適包被濃度為1.0 mg/mL，C線包被濃度為0.5 mg/mL，制備能夠快速檢測(cè)豬肉中西馬特羅殘留量的膠體金快速檢測(cè)卡，卡片靈敏度為 10 ng/mL，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅無交叉反應(yīng)，特異性好。與酶聯(lián)免疫吸附法的20份樣品符合率良好，說明新研發(fā)的檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，具有應(yīng)用價(jià)值，可在屠宰、養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中完成豬肉西馬特羅的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

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