maspin在食管鱗狀細胞癌中的表達及其與微血管密度的關系

宋文慶 武世伍 俞 嵐 周 蕾 承澤農 陶儀聲

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學院病理學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，安徽233030）

全球每年新增食管癌病人48萬余例，在所有男性惡性腫瘤中占第六位［1］，東亞是食管癌高發(fā)地區(qū)（尤其是中國、韓國和日本），其中90%以上的食管癌是鱗狀細胞癌［2－3］。抑癌基因的缺失可能參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展，而腫瘤誘導的血管生成可能進一步促進腫瘤的侵襲、進展及轉移。抑癌基因maspin屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，是通過消減雜交技術對正常乳腺組織與乳腺癌組織比較時發(fā)現的。近年來的研究表明，maspin具有調節(jié)腫瘤細胞生長和侵襲的能力，包括血管生成、細胞黏附和運動等［4－8］。微血管密度（microvessel density，MVD）是反映腫瘤血管生成情況的一個很好的指標，與腫瘤的轉移及預后密切相關。本研究通過檢測100例食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者中 maspin與CD34蛋白的表達，分析maspin與MVD之間的關系，并探討它們與食管鱗狀細胞癌浸潤、轉移及預后的關系。

材料和方法

1．一般資料

收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科2005年1月至2006年6月存檔石蠟包埋ESCC組織標本100例（術前未行放、化療）和正常食管組織30例，所有病例均有完整的臨床病理資料及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2012年4月，隨訪時間為7－84個月（中位時間41．9±28．0）。其中男性77例，女性23例；年齡22－79歲，中位年齡60．7±9．7歲；從腫瘤位置來看，上段6例，中段73例，下段21例；腫瘤長徑≥3．0cm有55例，＜3．0cm有45例；根據腫瘤分化程度，高分化26例，中分化52例，低分化22例；根據腫瘤浸潤深度，黏膜下層13例，肌層41例，外膜33例，穿透外膜13例；按淋巴結有無轉移，有轉移41例，無轉移59例；根據AJCC2010版pTNM分期標準進行分期，I期10例，II期45例，III期43例，IV期2例。30例正常食管組織作為對照。

2．試劑

鼠抗人maspin（克隆號EAW24）和CD34單克?。寺√?QBEnd／101），抗體購自 LabVision公司，ElivisonTM plus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術公司。

3．免疫組織化學

將石蠟包埋組織以4μm厚連續(xù)切片，烤干，于二甲苯溶液及梯度濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組織化學染色操作步驟按試劑盒說明書進行。采用已知陽性片作對照，以PBS液代替一抗作空白對照。然后依次蘇木素淡染細胞核、鹽酸酒精分化、返藍、脫水透明，最后中性樹膠封片。

4．免疫組織化學結果判定

maspin以細胞核或漿出現黃色或棕黃色顆粒為陽性；CD34以細胞漿或膜出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。MVD通過CD34陽性的小血管來計數，參考修正的Weidner［9］。免疫組織化學結果采取二次計分法：每例標本隨機計數10個高倍視野（×400），計數每個高倍視野中陽性細胞所占百分比并計分。具體方法見參考文獻［10］，若積分＜3分為陰性，≥3分為陽性。免疫組織化學結果由兩位病理醫(yī)生采用獨立雙盲法判定。

5．統(tǒng)計分析

采用SPSS20．0統(tǒng)計軟件進行數據分析。maspin表達與MVD（因 MVD計數的中位值為20．4±8．0，故以MVD＜20為陰性，MVD≥20為陽性）陽性組與陰性組生存分析用Kaplan－Meier法，組間比較采用log－rank檢驗；多因素分析采用Cox回歸多因素模型分析；在ESCC組織中，maspin的表達以及MVD計數與正常食管組織、各臨床及病理因素的相關性采用χ2、Spearman等級相關以及t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．maspin在ESCC及對照組中的表達

在ESCC組織中maspin主要定位于細胞核，胞漿中也偶有表達；在對照組中，maspin主要表達于基底細胞中［11］。maspin在對照組中均有表達（30／30），而ESCC中，maspin的陽性表達率為43．0%（43／100），maspin在二組之間的表達有顯著性差異（P＜0．05，圖1A，1B）。

2．maspin與臨床病理因素的關系

maspin的表達與患者性別、腫瘤大小及位置無相關性（P＞0．05）。隨著ESCC的分化越差，maspin的表達率越低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；隨著ESCC癌細胞浸潤越來越深，maspin的表達率越來越低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；maspin的表達率與淋巴結轉移有關，淋巴結轉移組中maspin表達率明顯低于無淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．001）maspin的陽性表達與生存期長短有關，在有淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組中，maspin陽性表達組生存期均要長于其陰性表達組（圖2A，2B），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．001）；maspin的表達與腫瘤分期有關，I－II期腫瘤組織中maspin的陽性率為65．5%（36／55），III－IV 期腫瘤組織中 maspin的陽性率為15．6%（7／45），兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，見表1）。

3．MVD與臨床病理因素的關系（圖1C，1D）

在maspin陽性表達組，MVD的均值為16．8±6．8），在maspin陰性表達組，MVD的均值為23．2±7．8，即maspin陽性表達組中的MVD計數顯著高于maspin陰性表達組（表1）。MVD計數與腫瘤大小、分化、浸潤深度、臨床分期及淋巴結轉移均呈正相關（P＜0．05，見表1），同時，在無淋巴結轉移組中，MVD＞22組的病人生存期明顯短于MVD＜22組的病人，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．001），但是在有淋巴結轉移組中，MVD＞22組的病人生存期與MVD＜22組的病人相比沒有差異性（P＞0．05）（圖3A，3B）

表1 ESCC中maspin表達和MVD計數與臨床病理因素的關系Table 1 Correlation of mircovessel density to maspin expression in Esophageal Cancer

4．預后及多因素分析

maspin陽性表達組的生存率顯著高于陰性表達組（P＜0．001，圖4A）；MVD≥22組的生存率顯著低于 MVD＜22組的生存率（P＜0．001，圖4B）。多因素分析顯示淋巴結轉移、pTNM分期、maspin的陽性及MVD計數均是影響ESCC患者的獨立預后因素（P＜0．05，表2）。

表2 100例ESCC患者多因素分析Table 2 Multivariate survival analysis of 100patients with esophageal cancer

討 論

maspin是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，位于染色體18q21．1－q23，編碼一個42kDa的蛋白，在正常乳腺中可以檢測到 maspin的表達［12］。maspin可以調節(jié)腫瘤細胞的生長、侵襲及轉移。為了研究maspin在ESCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，我們通過免疫組織化學檢測maspin蛋白在對照組食管組織及ESCC中的表達情況。在對照組中，maspin蛋白的陽性表達率為100%，而在ESCC組中，maspin蛋白的陽性表達率為43．0%。從對照組到ESCC組中，maspin的表達是降低的。進一步研究表明，maspin蛋白的表達水平與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期等密切相關。即maspin的表達越低，腫瘤的分化越差、浸潤越深、臨床分期越高及易發(fā)生淋巴結轉移，提示maspin的表達降低或缺失可能會影響ESCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉移，可能在食管上皮細胞的惡性轉化過程中起重要的作用，是早期的分子事件［13］。

眾所周知，在腫瘤的生長和轉移過程中，腫瘤需要足夠的血供及營養(yǎng)。當腫瘤發(fā)展到直徑大于1mm3時，就會誘導血管形成以獲取足夠的血供。腫瘤血管形成可以通過原有血管內皮細胞的芽生，也可以通過誘導血管內皮前體細胞分化成內皮細胞而后形成血管。監(jiān)測血管生成活性的重要指標－MVD，CD34標記的MVD能更好的反映腫瘤的血管生成活性［14－15］。本研究發(fā)現，在發(fā)生淋巴結轉移的病例組中，其MVD計數明顯高于未發(fā)生淋巴結轉移的病例組，因此MVD與淋巴結轉移有關；MVD與腫瘤的大小、分化程度、浸潤深度及臨床分期等都有關，而與患者的性別、年齡及腫瘤的位置等無關。

本研究表明，在ESCC中，maspin蛋白的表達與MVD計數具有顯著的負相關性。maspin是絲氨酸激酶及MMPs抑制劑，而它們都與腫瘤進展有關；maspin可以通過減少腫瘤相關的MVD數量而抑制腫瘤的生長［16］。隨著腫瘤的進展，maspin基因表達缺失或降低，喪失了對MMPs和MVD的抑制作用；且MMPs可以降解細胞外基質，從而使腫瘤細胞可以輕易地進入循環(huán)系統(tǒng)，造成侵襲和轉移。

襲和轉移是惡性腫瘤的生物學特征，術后復發(fā)和轉移是造成ESCC患者治療失敗的主要原因。本研究多因素分析表明，淋巴結轉移、pTNM分期、maspin的陽性表達及MVD計數是ESCC患者的獨立預后因素（P＜0．05）。盡管pTNM分期作為腫瘤的治療標準已為人們所接受，但是尋找一些能對pTNM分期起到一定補充作用的分子標記物并可以反映腫瘤的生物學行為的分子標記物也很重要。

生存分析表明，maspin蛋白表達陽性組的生存率明顯高于其陰性組，而且，無論淋巴結有無轉移，maspin陽性表達組的生存期也都明顯高于陰性表達組，即maspin陽性表達的腫瘤患者生存率較高［17］，生存期較長；MVD≥22組的生存率明顯低于MVD＜22組，MVD計數高的腫瘤患者生存率低［14，18］，在沒有發(fā)生淋巴結轉移的病例組中，MVD≥＞22組的病人生存期也明顯短于MVD＜22組的病人，但是在淋巴結轉移組中MVD≥22組的病人生存期與MVD＜22組的病人相比沒有差異性，考慮可能由于樣本量較小，不能完全反映MVD計數的高低與病人生存期長短的關系，有待于進一步的研究。

綜上所述，通過在ESCC組織中檢測MVD計數及maspin的表達，發(fā)現MVD計數高以及maspin表達缺失或降低的ESCC腫瘤細胞可能更容易侵襲、發(fā)展以及轉移。因此，MVD計數和maspin可作為評估ESCC患者轉移和預后的指標。

圖 版 說 明

圖1 maspin在食管鱗狀細胞癌與正常食管黏膜中的表達A，B 在對照組和ESCC中maspin的表達，主要定位于細胞核（A對照組B食管鱗狀細胞癌，ElivisionTMplus×400）；C，D MVD與臨床病理因素的關系（ElivisionTMplus×400）

圖2 A無淋巴結轉移組中maspin陽性組與陰性組ESCC患者生存曲線（log－rank檢驗，P＜0．001）；B有淋巴結轉移組中maspin陽性組與陰性組ESCC患者生存曲線（log－rank檢驗，P＜0．001）

圖3 A無淋巴結轉移組中，MVD≥22組與MVD＜22組的患者生存曲線（log－rank 檢驗，P＜0．001）；B有淋巴結轉移組中，MVD≥22組與 MVD＜22組的患者生存曲線（log－rank檢驗，P＞0．05）

圖4 maspin和MVD陽性組與陰性組ESCC患者生存曲線（log－rank檢驗），A maspin表達陽性組與陰性組ESCC患者生存曲線（P＜0．001）；B MVD≥22組與MVD＜22組ESCC患者生存曲線（P＜0．001）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1maspin in normal esophageal tissue and esophageal squamous cell carcinoma A，B：Expression of maspin in cell nucleus（A ．the control group B．esophageal squamous cell carcinoma，ElivisionTMplus ×400）；C，D：MVD relation with clinical pathological factors

Fig．2A：Survival curves of ESCC patients in maspin positive group and negative group without lymph node metastasis group（log－rank test，P＜0．001 ）；B：Survival curves of ESCC patients in maspin positive group and negative group with lymph node metastasis group（log－rank test，P＜0．001）

Fig．3A：Group without lymph node metastasis，MVD≥22 groups and MVD＜22groups of patients survival curves（log－rank test，P＜0．001）；B Group withlymph node metastasis，MVD≥22groups and MVD＜22groups of patients survival curves（log－rank test，P＞0．05）

Fig．4Maspin and MVD positive group and negative group ESCC patients survival curves（log－rank test）A：The expression of Maspin positive group and negative group ESCC patients survival curve（P＜0．001）；B：MVD≥22 group and MVD＜22group ESCC patients survival curve（P＜0．001）

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