慢性呼吸道感染患者呼吸道分泌物分離奈瑟菌的cppB 與pJD1 基因檢測

唐利亞，李杰，嚴(yán)潔

（1永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425100；2永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南 永州 425100 ）

0 引言

奈瑟菌是臨床呼吸道感染患者呼吸道中常見的正常菌種，相對于淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌而言，這些正常菌群缺乏菌毛及外膜蛋白質(zhì)這樣的致病相關(guān)因素通常對人體不會產(chǎn)生致病性[1-2]。但是存在于慢性呼吸道感染患者呼吸道中的有些奈瑟菌可能會對患者造成繼發(fā)性感染或?qū)δ行曰颊叩纳诚到y(tǒng)造成感染，這可能對患者原發(fā)疾病的診斷造成一定影響，造成誤診或漏診發(fā)生[3-4]。cppB與pJD1基因檢測在對淋病奈瑟菌的檢測中具有明顯的特異性反應(yīng)因此成為快速鑒別淋病奈瑟菌和診斷淋病的常用檢測手段，但近年來有學(xué)者指出該檢測方法對存在細(xì)胞壁缺失的奈瑟菌存在漏檢的情況因而對其臨床檢測價值不予支持。本研究對我院收治的98例慢性呼吸道感染患者進(jìn)行痰標(biāo)本分離，對不同的奈瑟菌檢測結(jié)果進(jìn)行分析，詳細(xì)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2018年5月-2019年5月在我院接受治療的98例慢性呼吸道感染患者作為菌株來源，對患者進(jìn)行痰標(biāo)本菌株分離。標(biāo)本來源患者中共有男47例，女51例，其中慢性支氣管炎患者有26例，年齡12～31歲，平均（25.62±4.32）歲；支氣管擴(kuò)張伴感染患者有24例，年齡10～59歲，平均（45.62±3.67）歲；支氣管哮喘患者有32例，年齡9～27歲，平均（19.66±3.52）歲；肺癌伴感染的患者有16例，年齡15～26歲，平均（18.67±4.22）歲。所有痰液標(biāo)本中共分離出奈瑟菌株368株，菌種9種。其中淺黃色奈瑟菌25株，微黃奈瑟菌46株，干燥奈瑟菌37株，嗜乳糖奈瑟菌48株，黏液奈瑟菌26株，多糖奈瑟菌52株，灰色奈瑟菌65株，脫氨奈瑟菌49株以及淋病奈瑟菌20株。98例患者痰液標(biāo)本檢出奈瑟菌菌種分布情況，詳見表1。

表1 檢出奈瑟菌菌種分布情況[n(%)]

1.2 檢測方法

（1）試劑與儀器選擇。緩沖液、dNTPs、MgCl2以及Taq DNA聚合酶均產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA標(biāo)志物購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，瓊脂糖、TBE緩沖液、ED-TA購自金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司，PCR儀型號為KS48+，購自冠森生物科技（上海）有限公司，凝膠成像使用E-Gel Imager凝膠成像儀進(jìn)行觀察，熒光定量PCR儀型號為Q2000B，購自上海般諾生物科技有限公司。

（2）基因檢測。使用cppB特異性引物對各菌株染色體DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性60s，55℃退火40s，72℃延伸10min，用5μL的擴(kuò)增產(chǎn)物對1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，使用溴化乙錠進(jìn)行染色處理后對凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果進(jìn)行觀察記錄。

pJD1檢測使用淋球菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測嚴(yán)格按照試劑盒推薦方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

對分離出的奈瑟菌屬菌種進(jìn)行檢測，共有90株奈瑟菌檢出cppB陽性占比為24.46%，51株檢出pJD1陽性，占比為13.86%。其中cppB檢測干燥奈瑟菌與黏液奈瑟菌檢出率均為100%，淋病奈瑟菌cppB與pJD1檢測均表現(xiàn)為陽性反應(yīng)。368株奈瑟菌cppB與pJD1基因檢測結(jié)果，詳見表2。

表2 奈瑟菌cppB與pJD1基因檢測結(jié)果[n(%)]

3 討論

奈瑟菌屬是格蘭陰性雙球菌，是β-變形菌類中的一種無芽孢，無鞭毛，有菌毛，專性需氧，氧化酶陽性細(xì)菌[5]。奈瑟菌形狀酷似球形，通常兩兩成對排列，形狀類似咖啡豆，通常該菌種位于人體中性粒細(xì)胞內(nèi)，而在人體患有慢性淋病時常位于細(xì)胞外，新分離的菌株有莢膜和菌毛。奈瑟菌屬包括腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌、淺黃奈瑟菌、黏液奈瑟菌等多種菌株，其中能夠引起人體發(fā)病的只有腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌兩種，通過標(biāo)本圖片檢測就能夠在顯微鏡下清晰觀察到中粒細(xì)胞內(nèi)存在的腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌成雙排列[6-7]。除了這兩種奈瑟菌，其他奈瑟菌通常寄生在人體呼吸道中，多存在于細(xì)胞之外，為正常菌群。正常菌群由于其缺少重要的致病性菌毛與蛋白質(zhì)對人體不具有致病性，但是仍然能夠通過對人體呼吸道造成影響使其產(chǎn)生繼發(fā)性感染或?qū)δ行陨称鞴僭斐筛腥?，在臨床檢查中常常會因?yàn)檫@些正常菌群造成誤診或漏診，對患者及時有效的治療造成了一定的影響[8]。奈瑟菌的致病物質(zhì)主要有莢膜、菌毛以及內(nèi)毒素，莢膜具有抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用，菌毛有助于細(xì)菌附著于細(xì)胞表面，利于進(jìn)一步侵入人體組織。內(nèi)毒素是主要致病物質(zhì)，由細(xì)菌自溶或裂解釋放，可使小血管、毛細(xì)血管形成血栓引起出血，嚴(yán)重時造成DIC、中毒性休克。致病性的奈瑟菌能夠通過呼吸吸入的飛沫傳播，也可通過被患者呼吸道分泌物污染的日?；蜥t(yī)療用品而感染。潛伏期最長可達(dá)10天，因此容易被人們忽視。病菌集中在鼻咽部進(jìn)行繁殖，之后侵入血流，進(jìn)而引起菌血癥或敗血癥。出現(xiàn)該類感染患者通常會出現(xiàn)惡寒、高燒、惡心、嘔吐、皮膚或黏膜出現(xiàn)出血點(diǎn)或出血斑等臨床癥狀。如果細(xì)菌通過血腦屏障到達(dá)腦脊膜，產(chǎn)生化膿性炎癥，病人則表現(xiàn)為劇烈頭痛、噴射狀嘔吐、頸項(xiàng)強(qiáng)直等腦膜刺激癥狀。暴發(fā)型流腦起病急且十分兇險，若未能進(jìn)行及時搶救就可能導(dǎo)致患者死亡。因此對患者采取有效的鑒定方式盡早發(fā)現(xiàn)其致病風(fēng)險所在對提高臨床治愈率，減少患者發(fā)病風(fēng)險甚至是死亡率具有明顯作用。一般來講，如果急性呼吸道感染無法得到徹底治療就可能發(fā)展成慢性呼吸道感染疾病，慢性呼吸道感染疾病沒有急性呼吸道感染發(fā)病時的明顯特征及表現(xiàn)，因而通常會被人們忽略，因而耽誤治療，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化[9-10]。對慢性呼吸道感染患者分泌物中的奈瑟菌行cppB與pJD1基因檢測是考慮到這兩種檢測方式對淋病奈瑟菌的特異反應(yīng)明顯因而能夠?qū)颊叽嬖诘臐撛诨疾★L(fēng)險進(jìn)行盡早發(fā)現(xiàn)并給予針對向治療，對減少患者患病風(fēng)險及提升公共衛(wèi)生安全均具有明顯作用。尤其是兒童患者群體由于其自身免疫能力低下，容易遭受病菌感染，一旦淋病致病原菌造成了患者感染就容易造成其泌尿生殖系統(tǒng)黏膜的急性或慢性化膿性感染并存在傳染性風(fēng)險。

本研究結(jié)果中從慢性呼吸道感染患者痰液中分離出了9種致病菌，經(jīng)過分別對幾種菌株進(jìn)行cppB及pJD1基因檢測，結(jié)果顯示其中cppB基因檢測對微黃奈瑟菌和黏液奈瑟菌的檢出率最高，而淋病奈瑟菌在cppB及pJD1檢測中均表現(xiàn)為陽性反應(yīng)，檢出效果明顯。淋病奈瑟菌在人體中位移對泌尿生殖系統(tǒng)造成感染的奈瑟菌屬菌種，臨床上通常利用其培養(yǎng)特性對染色體形態(tài)進(jìn)行觀察或利用氧化酶試驗(yàn)等方法對其進(jìn)行檢測以檢出其是否存在或?qū)α懿∵M(jìn)行診斷。cppB及pJD1基因檢測也是檢測淋病奈瑟菌的常用方式且具有較高的檢出率，對盡早發(fā)現(xiàn)患者患病風(fēng)險，進(jìn)行積極應(yīng)對具有重要作用。此外本研究結(jié)果證實(shí)cppB及pJD1基因檢測并不僅僅對淋病奈瑟菌具有特異性，對淺黃奈瑟菌、微黃奈瑟菌、干燥奈瑟菌、嗜乳糖奈瑟菌、黏液奈瑟菌及多糖奈瑟菌進(jìn)行cppB基因檢測均有陽性反應(yīng)，其中干燥奈瑟菌和黏液奈瑟菌的檢出率達(dá)到了100%。對微黃奈瑟菌、嗜乳糖奈瑟菌、黏液奈瑟菌、多糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、脫氨奈瑟菌進(jìn)行pJD1檢測也存在陽性反應(yīng)，其中黏液奈瑟菌和脫氨奈瑟菌的檢出率相對較高。說明cppB及pJD1基因檢測的特異性在其他奈瑟菌菌種中都廣泛存在，具有較高的臨床應(yīng)用價值，對提升臨床診斷的準(zhǔn)確性和早期診斷具有重要意義。

綜上所述，慢性呼吸道感染患者呼吸道中存在的正常奈瑟菌群也會引起患者泌尿生殖系統(tǒng)感染，可能引起尿道炎等疾病。對正常奈瑟菌進(jìn)行cppB及pJD1基因檢測時也會出現(xiàn)較為明顯的反應(yīng)，因此在臨床診斷中需要對患者進(jìn)行病原體分析聯(lián)合常規(guī)細(xì)菌檢測提高診斷的準(zhǔn)確性。