石杉堿甲改善Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體毒性

侯添志 陳慶狀 歐陽勇 肖曉丹,3

1 廣州市花都區(qū)第二人民醫(yī)院 廣東廣州 510850； 2 廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 廣東廣州 510800； 3 廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東湛江 524023

阿爾茨海默病(AD)是癡呆癥最常見的病因，患者臨床表現(xiàn)為逐漸喪失記憶和認(rèn)知功能[1-3]。β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)作為AD的主要神經(jīng)毒性物質(zhì)，其刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥誘導(dǎo)神經(jīng)元線粒體功能障礙越來越被認(rèn)為是AD發(fā)病的最具代表性的病理生理特征[4-5]。石杉堿甲(huperzine A，HupA)是一種石松類生物堿，除具有典型的抑制膽堿酯酶活性的特性之外，研究顯示其尚可減輕腦外傷炎癥，并對Aβ直接誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體毒性發(fā)揮保護(hù)作用[6]。另外，我們前期研究顯示石杉堿甲對APP/PS1小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體具有保護(hù)作用[7]，但對其能否在Aβ間接誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體毒性過程中發(fā)揮保護(hù)作用仍需進(jìn)一步探討。因此，本研究將利用Transwell構(gòu)建小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)體系，向小膠質(zhì)細(xì)胞層加入Aβ1-42可模擬AD患者腦內(nèi)的炎癥環(huán)境，向神經(jīng)元細(xì)胞層加入石杉堿甲，觀察其對Aβ間接誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體毒性的保護(hù)作用。

1 主要材料

新生SD大鼠(出生后1～2 d)由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。0.4 μm Transwell培養(yǎng)板(Corning)、ATP試劑盒、ROS試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、MDA試劑盒、MTT試劑盒(碧云天)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1～2 d的SD大鼠，75%酒精消毒，斷頭，取海馬組織，巴氏管吹散，胰酶消化，過濾，離心，得到離散細(xì)胞，重懸于含有10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液。接種于預(yù)包被多聚賴氨酸的75 cm2培養(yǎng)瓶中，2 d后全量換液，培養(yǎng)7～10 d，手搖法分離小膠質(zhì)細(xì)胞。

2.1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞接種于含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞占瓶底70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 共培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建

小膠質(zhì)細(xì)胞與PC12細(xì)胞以1 ∶1的比例依次接種于Transwell培養(yǎng)板下室(6孔板，1×105細(xì)胞/毫升)和上室(1×105細(xì)胞/毫升)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共分為3組。①對照組：小膠質(zhì)細(xì)胞和PC12細(xì)胞分別接種于Transwell培養(yǎng)板下室和上室；②Aβ1-42組：操作同①，小膠質(zhì)細(xì)胞層加入Aβ1-42(終濃度10 μmol/L)。③HupA組：操作同②，PC12細(xì)胞層加入HupA(終濃度1 μmol/L)預(yù)處理4 h。

2.4 活性氧(ROS)檢測

收集處理好的PC12細(xì)胞。根據(jù)ROS檢測試劑盒說明書提示，用DCFH-DA(10 μL，10 μM)在37 ℃下染色20 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 總SOD活性和MDA水平檢測

收集處理好的PC12細(xì)胞，然后用WST-8總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒測定T-SOD活性，并根據(jù)脂質(zhì)氧化MDA(丙二醛)試劑盒說明書的指示測定PC12細(xì)胞MDA水平。

2.6 ATP檢測

收集處理好的PC12細(xì)胞，根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書提示，加入100 μL ATP釋放劑，加入熒光素底物和熒光素酶避光孵育10 min，Perkin Elmer酶標(biāo)儀檢測生物發(fā)光強(qiáng)度。

2.7 MTT檢測

收集各組PC12細(xì)胞，接種于96孔板(3×104細(xì)胞/孔)，加入MTT(20 μL，0.5 mg/mL)，在37 ℃孵育4 h。去除上清液，加入150 μL DMSO。用酶標(biāo)儀在波長為492 nm處檢測吸光度。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組間比較分析用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 石杉堿甲減輕Aβ1-42間接誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體損傷

圖1A結(jié)果顯示，Aβ1-42組的PC12細(xì)胞ROS水平相對對照組有顯著性上升，增加約70%～80%(P<0.001)，HupA處理后的PC12細(xì)胞則有顯著性的下降(P<0.001)。圖1B顯示，與對照組相比，Aβ1-42組PC12細(xì)胞MDA水平上升約50%(P<0.001)，而PC12細(xì)胞經(jīng)HupA預(yù)處理后的MDA水平較Aβ1-42組顯著性下降約20%～30%(P<0.001)。從圖1C中可以看到，Aβ1-42組PC12細(xì)胞的T-SOD水平顯著性下降(P<0.001)，而HupA可以有效地逆轉(zhuǎn)這種下降的趨勢(P<0.001)。另外，從圖1D中可以看到，與對照組對比，Aβ1-42組PC12細(xì)胞線粒體的ATP呈現(xiàn)顯著性下降，下降幅度約為50%(P<0.001)，而HupA預(yù)處理后的PC12細(xì)胞線粒體的ATP水平有明顯的上升(P<0.001)。

3.2 石杉堿甲改善Aβ1-42間接誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性

圖2結(jié)果顯示，與對照組對比，Aβ1-42組的PC12細(xì)胞活性降至只有60%左右(P<0.001)。而HupA預(yù)處理后的PC12細(xì)胞活性則顯著性上升至約為對照組的80%左右(P<0.001)。

注：A為活性氧(ROS)水平檢測(n=6);B為脂質(zhì)氧化(MDA)水平檢測(n=6)；C為總超氧化物歧化酶(T-SOD)水平檢測(n=6);D為線粒體ATP水平檢測(n=6), Mean±SEM, ***P<0.001

注：采用MTT試劑盒檢測PC12細(xì)胞活性, n=8,Mean±SEM, ***P<0.001

4 討論

石杉堿甲是中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的AD治療藥物，在中國臨床上廣泛使用，目前正在美國進(jìn)行臨床前試驗(yàn)[8]。在本研究中，我們探討了HupA在Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體毒性過程中的作用。

ROS主要來源于線粒體，是一類具有較高氧化活性的分子或離子。ROS的過量產(chǎn)生可損害蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子的活性，導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞凋亡[9-10]。為了檢測石杉堿甲是否能減輕Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用ROS敏感的DCFH-DA染料測定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。Aβ1-42介導(dǎo)的PC12細(xì)胞的ROS水平顯著升高，而石杉堿甲可以有效逆轉(zhuǎn)ROS升高的趨勢。眾所周知，ROS引起細(xì)胞損傷的一個(gè)重要方面的體現(xiàn)是導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化[11-12]。MDA是脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)品，也可以反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平[13]。通過采用MDA試劑盒檢測PC12細(xì)胞的MDA水平，我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PC12細(xì)胞MDA水平增加到約為對照組的1.5倍，石杉堿甲干預(yù)后可將PC12細(xì)胞MDA水平降低至約為對照組的1.2倍。結(jié)合上述結(jié)果，提示石杉堿甲可以顯著減輕Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。

ATP作為線粒體電子傳遞中最重要的產(chǎn)物，是維持細(xì)胞正常功能所必需的能量物質(zhì)[15]。ROS的增加，將導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化失常，從而影響ATP的生成。因?yàn)锳TP水平與線粒體活性密切相關(guān)，所以我們進(jìn)一步檢測ATP水平來評估PC12細(xì)胞線粒體功能。結(jié)果表明Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞對共培養(yǎng)的PC12細(xì)胞線粒體ATP水平有顯著的下降，而石杉堿甲可以有效地逆轉(zhuǎn)PC12細(xì)胞線粒體ATP水平?？傊?，石杉堿甲可以有效抵抗Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞對PC12細(xì)胞線粒體的損傷。

過量的ROS加劇線粒體功能障礙，增加線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)，加速細(xì)胞色素c(cytoc)向細(xì)胞質(zhì)的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)caspase相關(guān)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)caspase依賴的凋亡級聯(lián)[16]。因此我們利用MTT試劑盒檢測PC12細(xì)胞活性,進(jìn)一步探討石杉堿甲是否發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞活性保護(hù)作用。結(jié)果顯示經(jīng)石杉堿甲預(yù)處理的PC12細(xì)胞活性對比Aβ1-42組顯著增加，提示石杉堿甲在Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性過程中具有保護(hù)作用。

綜上所述，石杉堿甲通過改善Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體毒性發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞活性的保護(hù)作用。