苧麻炭疽菌研究進展

王緒霞，湯滌洛，劉立軍

（1.武昌首義學院城市建設(shè)學院，湖北 武漢 430064；（2.咸寧市農(nóng)業(yè)科學院，湖北 咸寧 437100；（3.華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070）

苧麻（Boehmeria nivea L.Gaud.）為蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）多年生宿根性韌皮纖維作物，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。中國是苧麻種質(zhì)資源、遺傳多樣性最豐富的國家［2］，種植面積和原料產(chǎn)量均占世界的95%以上，處于優(yōu)勢地位［3］。苧麻在生長過程中易受真菌、細菌、病毒和線蟲等病原的危害，其中炭疽病是苧麻上發(fā)生普遍且嚴重的病害之一，給苧麻生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟損失［4-6］。苧麻炭疽病在我國長江流域以南各省麻區(qū)均有發(fā)生，苧麻各個生育期都可受到危害，發(fā)病率達20%～40%，發(fā)生嚴重的麻園纖維產(chǎn)量減產(chǎn)10%以上，刮制后的原麻呈現(xiàn)出紅褐色斑點，嚴重影響苧麻纖維的品質(zhì)［7-9］。本文從苧麻炭疽病的癥狀、病原菌的分類地位、病原菌鑒定、生物學特性等方面進行綜述，旨在為深入研究該病的發(fā)生流行規(guī)律、抗病材料的選育及該病的綜合防治提供參考。

1 苧麻炭疽病癥狀

苧麻炭疽病在苧麻各產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，重病地幼苗往往成片倒伏死亡，成株發(fā)病病葉穿孔，葉片發(fā)黃早落，纖維易斷或變紅，難于漂白［10］。田間被害葉片最初產(chǎn)生圓形小斑點，中央灰白色，周圍褐色或黑褐色，后期多個病斑連成不規(guī)則斑，嚴重時導致葉片枯落。葉柄和莖上病斑呈梭形或紡錘形，邊緣褐色，中央灰白色、凹陷。發(fā)病后期，莖葉上病斑可能有分生孢子盤和分生孢子的生成［5］。

2 苧麻炭疽病病原學

2.1 苧麻炭疽菌的分類鑒定

苧麻炭疽病由炭疽菌屬（Colletothrichcum）真菌引起。植物炭疽病菌屬半知菌亞門真菌，作為一類全球性分布的重要植物病原菌，可危害林木、果樹、蔬菜、花卉、藥用植物和大田作物，造成嚴重經(jīng)濟損失［11-12］，目前已報道約176屬190余種植物可被炭疽菌侵染［13］。真菌病理學家根據(jù)科學/經(jīng)濟重要性，將該屬真菌列為全球第八大植物病原真菌［14］。但是，在真菌學研究及發(fā)展中，炭疽菌類真菌命名方式和系統(tǒng)學分類上發(fā)生過數(shù)次重大的變更，存在種間性狀交叉和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不清的分類學問題。前人［15-16］進行了有關(guān)建立和確認炭疽菌屬分類的研究，將Colletotrichum Cda.認定為其屬名，又稱刺盤孢屬。

苧麻炭疽病菌的鑒定研究起于1914年，由日本學者Sawada（澤天兼吉）在中國臺灣首次分離，此后對該病菌的形態(tài)學進行了觀察與分析［17］。根據(jù)分離菌株的菌絲顏色，分生孢子、剛毛、分生孢子梗大小等形態(tài)特征，以及當時炭疽菌屬的命名規(guī)則，Sawada將苧麻炭疽病菌命名為Colletotrichum boehmeriae Sawada，病原為炭疽菌屬真菌（Colletotrichum Corda），但是并未確定病原所屬的種。此后，國內(nèi)對于苧麻炭疽病的研究報道中，皆以C．boehmeriae Sawada為苧麻炭疽病菌的病原進行標注和引用。然而，該命名法是根據(jù)寄主來源和其發(fā)現(xiàn)者名字命名的，C．boehmeriae Sawada并不能顯示該病害真正的病原和分類地位。鑒定和明確引起苧麻炭疽病的病原及其分類地位，對病菌的研究及病害防治至關(guān)重要。

真菌鑒定中形態(tài)學鑒定是最傳統(tǒng)也最重要的真菌鑒定手段，以純培養(yǎng)物上產(chǎn)生的分生孢子、附著胞、分生孢子梗和產(chǎn)孢細胞的形態(tài)和大小，菌核、厚垣孢子的有無及形態(tài)等特征為主要鑒定依據(jù)［18-19］。一些特征明顯的炭疽菌種采用形態(tài)學能夠容易被鑒定出來，但是一些近似炭疽菌種卻難以準確區(qū)分，并且一些菌株形態(tài)學特征不夠穩(wěn)定，也易受到培養(yǎng)條件、寄主范圍等多因素影響，因此形態(tài)學鑒定存在許多不足之處，需要借助分子手段進行輔助鑒定［20-21］。而分子系統(tǒng)學研究是從基因水平上客觀反映出菌株間遺傳特性，特異性高、準確可靠，DNA序列特征不會隨環(huán)境的改變而變化，由此越來越多的分子生物學技術(shù)被廣泛引入到真菌的分類鑒定當中。目前，基于多基因序列分析，如核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacers，ITS）［22-23］、肌動蛋白基因（Actin gene，ACT）［24］和 β-微管蛋白基因（β-tubulin，TUB2）［25-26］、幾丁質(zhì)合成酶 A基因（Chitin synthase A gene，CHS1）等［27-28］和 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyeeral-dehydes-3-phosphate dehydrogenase gene-GAPDH）等（表1），常用于炭疽菌屬分子鑒定。多基因序列分析能較好地區(qū)分炭疽菌屬真菌的大部分種，且不同基因位點能有效區(qū)分不同的炭疽菌種類，可用于炭疽菌復合群的種類鑒定。

表1 常用炭疽菌分子鑒定基因位點Table 1 Commonly genetic locus used formolecular identification of Colletotrichum species

國內(nèi)外對苧麻炭疽菌種類的報道相對較少。對采自湖北武漢、湖北咸寧、湖南長沙、江西宜春和四川達州5個地區(qū)的苧麻炭疽病進行分離和純化，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學和ITS、ACT和TUB2多基因序列對分離的菌株進行聯(lián)合鑒定，確定引起湖北、湖南和江西苧麻炭疽病的病原主要有膠孢炭疽菌（C．gloeosporioides）［30-32］、果生炭疽菌（C．fructicola）、暹羅炭疽菌（C．siamense）和希金斯炭疽菌（C．higginsianum）［33］，其中膠孢炭疽菌（C．gloeosporioides）為優(yōu)勢種。根據(jù)現(xiàn)在炭疽菌的分類系統(tǒng)，膠胞炭疽菌屬于復合種群，種群內(nèi)含有22個種［34］，果生炭疽菌（C．fructicola）和暹羅炭疽菌（C．siamense）都屬于膠孢炭疽菌復合群C．gloeosporioide s complex。另外，在報道［11］中指出，根據(jù)形態(tài)學和分子鑒定，部分分離自咸寧的菌株希金斯炭疽菌（C．higginsianum）依據(jù)現(xiàn)代炭疽菌分類標準屬于毀滅炭疽菌復合群C．destructivum complex。以上報道是對我國苧麻炭疽菌進行分類和鑒定的首次報道。但是總體看來，我國苧麻炭疽病的病原和分類地位都還未獲得詳細而系統(tǒng)的研究。苧麻的生長環(huán)境和品種在地區(qū)間存在差異，病原種類也可能存在顯著差異，因此有必要對我國苧麻主產(chǎn)區(qū)不同苧麻品種、地理來源以及不同發(fā)病部位的苧麻炭疽病開展系統(tǒng)性研究，以獲得更多關(guān)于苧麻炭疽菌病原和分類上的信息。

2.2 苧麻炭疽菌生物學特性

1991年，羅俊國［10］對湖北地區(qū)分離到的苧麻炭疽病病菌的培養(yǎng)性狀、生物學特性和主栽品種（品系）的炭疽病抗性做了鑒定。研究結(jié)果顯示，炭疽病菌能很好地利用硝態(tài)氮和有機氮，而對銨態(tài)氮利用很差，對單糖、雙糖和多糖能很好地利用，但對山梨糖、木糖利用率低。病菌的生物學特性研究結(jié)果顯示，病菌在17～33℃均能生長，最適生長溫度為25℃，病菌在偏酸和中性環(huán)境中生長良好，病菌經(jīng)56℃30 min可致死。1993年李瑞明等［9］報道的苧麻炭疽菌生物學特性與羅俊國的研究結(jié)果基本一致，并詳細報道了苧麻炭疽菌病原形態(tài)特性以及溫度和濕度對病菌生長和孢子萌發(fā)的影響。研究指出，苧麻炭疽菌菌絲最適生長溫度為28℃，35℃即可影響和抑制菌絲生長，菌絲致死溫度為55℃；菌絲在pH 4～9范圍內(nèi)均可生長，最適pH為中性偏酸性；分生孢子萌發(fā)需要高的濕度，相對濕度低于79.3%，不能萌發(fā)，62℃可使孢子致死。

本文作者以分離到的苧麻炭疽菌為對象研究其生物學特性。結(jié)果表明，病菌菌絲在20～30℃均可生長，最適溫度為25℃；分生孢子在20～30℃產(chǎn)量較高，28℃達到最高；菌絲在pH 4.0～10.0均能生長，在PDA（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）、PSA（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基）和苧麻葉片培養(yǎng)基上生長最快；在牛肉膏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多；菌絲對各種碳源的利用率都很高，其中對麥芽糖的利用效果最好；分生孢子產(chǎn)生方面，相同的氮源，碳源不同其產(chǎn)孢量差異很大，硝酸鉀和葡萄糖的結(jié)合可以誘導大量分生孢子的產(chǎn)生，在酵母膏為氮源的培養(yǎng)基里菌落直徑較小，但是產(chǎn)生的分生孢子數(shù)目巨大；在對生物量的研究中發(fā)現(xiàn)，添加維生素B2的液體培養(yǎng)基里可以獲得較大的生物量，同時也可以誘導大量分生孢子的產(chǎn)生；另外，菌落在12 h光暗交替條件下生長最快，但分生孢子產(chǎn)量低，連續(xù)黑暗培養(yǎng)更利于孢子的生成［17］。

2.3 苧麻炭疽病菌病原形態(tài)研究

苧麻炭疽病病原形態(tài)學觀察和分析的研究，最初見Sadawa的報道，其研究報告中指出苧麻炭疽菌形態(tài)為：菌絲無色，直徑4μm。分生孢子盤小、梗短，緊密并排，分生孢子無色，短圓柱形，一端稍細，兩端圓，有細顆粒狀內(nèi)含物。剛毛暗褐色，向頂部漸細，頂端尖，有1～2個隔膜，基部稍膨大，45～85μm×4～5μm［17］。1988年，上海市農(nóng)科院在引種苧麻的同時，對苧麻的病害進行了調(diào)查，檢測到多種病原真菌，其中對苧麻炭疽菌的顯微結(jié)構(gòu)首次做了描述：分生孢子盤大小不一，大的可達175μm，剛毛多而堅硬，雜生或周生于分生孢子梗之間及孢子盤周圍，分生孢子狹長橢圓形，單胞，大小為15～20μm×3.5～5.0μm［35］。

本文作者以分離的苧麻炭疽菌幾個種為研究對象，觀察了苧麻炭疽菌的形態(tài)。苧麻炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為：菌落呈圓形，菌落邊緣整齊。大部分菌株菌絲最初為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長變?yōu)榈疑械氖呛稚?。菌絲匍匐狀，稀疏至茂密，隨著培養(yǎng)時間的延長菌落背面為褐色、藍灰色甚至是墨綠色。分生孢子橘紅色，有的點狀分布，有的成片分布。分生孢子，單胞，無色透明，卵圓形，有的內(nèi)含油球。分生孢子梗簇生或單生，無色或淡褐色，直或彎曲，具分隔，基部略膨大。菌絲有隔，直徑2.55～3.83μm，平均3.01μm。有的菌株具黑色或者褐色剛毛，有分隔，頂端尖銳［17］。

圖1 苧麻炭疽菌形態(tài)培養(yǎng)特征［17］Fig.1 Morphology characteristic of Colletotrichum species of ramie anthracnose［17］

2.4 苧麻炭疽菌侵染特性研究

苧麻炭疽病菌主要傳播途徑為病殘體，種子也可帶菌，病菌以菌絲體在病殘組織和種子中越冬，散落在田間的病殘體和返回麻田的感病麻皮，成為翌年初次侵染源［9］，苧麻炭疽菌侵染過程與報道中膠孢炭疽菌的生活史基本一致（圖2）［36］。在苧麻生長期間，感病組織產(chǎn)生的分生孢子可借助風、雨、昆蟲等進行傳播，炭疽菌的分生孢子可以直接通過自然孔口-氣孔、皮孔或者傷口入侵，也可以直接入侵［37］，高溫多雨、偏施氮肥、密度過大以及低洼積水的麻地均有利病害的侵染和發(fā)生［6］。

圖2 膠孢炭疽菌的生活史［36］Fig.2 Life styles of Colletotrichum gloeosporioides［36］

苧麻炭疽菌屬于植物炭疽菌屬，植物炭疽屬病原真菌屬于半活體營養(yǎng)型寄生微生物，根據(jù)寄主不同而有不同的病菌侵染策略［38］（圖3）。病菌可以從細胞內(nèi)定殖到角質(zhì)層下部定殖侵染寄主，并通過形成特別的侵染結(jié)構(gòu)進行深入侵染。分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生附著胞，附著胞產(chǎn)生侵入釘，侵入釘產(chǎn)生侵染菌絲，侵染菌絲包括初生菌絲和次生菌絲。在侵入寄主植物前期，病菌并不立即殺死寄主，而是依靠活體寄主為營養(yǎng)體。在侵染后期，隨著侵染菌絲的蔓延，植物細胞死亡，真菌進入死體營養(yǎng)型寄生階段［39］。

圖3 炭疽菌屬真菌在侵染前期的不同侵染策略［38］Fig.3 Different infection strategies infected by Colletotrichum species［38］

3 展望

麻類作物作為我國重要的特色纖維作物，在種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了重要作用。長期以來，我國苧麻研究在種質(zhì)資源創(chuàng)新與鑒定、品種篩選、育種與繁育技術(shù)研究等方向取得了重要進展。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，苧麻全基因組測序工作已經(jīng)完成，在全基因組關(guān)聯(lián)分析、QTL定位、穩(wěn)定分子標記開發(fā)、miRNA研究［40］等方面也取得了系列重要成果。在麻類作物學科發(fā)展報告中提出，未來一段時間，我國麻類作物學科要以傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)為基礎(chǔ)，以分子育種技術(shù)為突破口，加強重要功能基因的挖掘，加快優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、抗病、抗逆、多用途等麻類作物新品種選育［41］。

國內(nèi)外麻類病害研究主要集中于亞麻、紅麻和工業(yè)大麻，對苧麻上經(jīng)常發(fā)生的病害，特別是炭疽病缺少詳細而系統(tǒng)的研究，病原菌鑒定、抗性基因的研究更是匱乏。苧麻生產(chǎn)中，由于缺少對炭疽菌完全免疫或高抗的苧麻品種，對該病害的防治比較困難。雖然依靠噴施殺菌劑可以防治病害，但是病原菌的頻繁變異使得化學藥劑易出現(xiàn)失效的現(xiàn)象，且持續(xù)施用殺菌劑不符合我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中“減藥”的目標。我國苧麻種植區(qū)域生態(tài)環(huán)境差別大，種植品種多，苧麻炭疽菌病原種類、致病性遺傳多樣性等方面可能存在差異。所以，對我國不同苧麻產(chǎn)區(qū)的苧麻炭疽菌開展基礎(chǔ)性研究具有重要的意義。通過對病原菌的分離和鑒定以及抗性基因的挖掘，明確我國苧麻炭疽菌的種類、優(yōu)勢種群、分布規(guī)律、遺傳多樣性、致病力差異及分化情況，不但可以掌握該病的發(fā)生流行規(guī)律，為病害的田間防控提供理論依據(jù)，降低病害對苧麻產(chǎn)量的影響，也將為研究苧麻炭疽病的生物防治提供指導，防止或減緩苧麻炭疽菌對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，為苧麻炭疽病的生物防治和抗炭疽病育種提供理論依據(jù)。