黃麻葉水解液中總黃酮、黃酮醇類組分含量及酪氨酸酶活性抑制分析

馮湘沅，楊琦，成莉鳳，鄭科，彭正紅，段盛文

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

黃酮類化合物（Flavonoids）是植物中重要的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括山奈酚（Kaempferol）、槲皮素 （Quercetin）、楊梅素 （Myricetin）和異鼠李素 （Isorhamnetin）等黃酮醇（Flavonols）類組分物質(zhì)，其多種生理功能已得到證實(shí)，黃酮化合物具有潛在促進(jìn)健康作用［1-2］。酪氨酸酶（tyrosinase，EC1.14.18.1）是一種含銅的金屬氧化還原酶，能催化L-酪氨酸羥基轉(zhuǎn)化成 L-多巴，再氧化形成多巴醌，經(jīng)一系列的酶促和非酶促反應(yīng)最終形成黑色素。在人體中，過多黑色素的積累會(huì)導(dǎo)致皮膚形成各類色斑等問題，只有通過抑制酪氨酸酶活性，才能減少黑色素的形成，達(dá)到美白效果。目前，常用的酪氨酸酶活性抑制劑大多是通過化學(xué)方法合成，存在著一定的副作用，而從植物中提取的黃酮類化合物則被認(rèn)為是理想的酪氨酸酶抑制劑之一［3-5］，因此，尋找安全、高效的黃酮類化合物植物和酪氨酸酶抑制劑在食品及醫(yī)藥方面具有重要意義。

黃麻（Jute）屬于錦葵科（Malvaceae）黃麻屬（Corchorus）一年生草本植物，約有100多個(gè)品種，其中不同品種黃麻葉片中均含有黃麻甙、黃麻酮及多糖類等化學(xué)成分，具有一定的抗氧化活性［6］。近年來，黃春梅［7］開展了水和微波法提取菜用黃麻（即長(zhǎng)蒴黃麻）中黃酮類化合物的研究；陳如冰等［8］研究了長(zhǎng)蒴黃麻總黃酮的提取及其抗氧化性。但尚未見有關(guān)不同品種黃麻葉中黃酮類化合物對(duì)抑制酪氨酸酶活性的報(bào)道。本文對(duì)不同品種黃麻葉在甲醇-鹽酸、加熱回流條件下進(jìn)行水解，檢測(cè)分析水解液中總黃酮、黃酮醇類組分含量及抑制酪氨酸酶活性，旨在為黃麻葉功能性食品、美容產(chǎn)品等的深度開發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：于湖南長(zhǎng)沙試驗(yàn)基地采摘的黃麻葉（苗后天數(shù)均為28 d），品種名稱分別為：黃德深紅皮（C．capsularis）、巴麻 72-3（C．olitorius）、中黃麻 4號(hào)（C．olitorius）。

試劑：異槲皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素、蘆丁等標(biāo)準(zhǔn)品購自Aladdin公司；福林酚、Tris、HCL、甲醇（色譜純）、磷酸（色譜純）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-抗壞血酸/Vc、酪氨酸酶（100KU）均為Aladdin公司產(chǎn)品。

PBS緩沖溶液：A液為稱取Na2HPO4·12H2O 71.63 g，用超純水溶解定容于1000 mL容量瓶中；B液為稱取NaH2PO4·2H2O 31.20 g，用超純水溶解定容于1000 mL容量瓶中；以A∶B＝51∶49的體積比混合，用pH計(jì)測(cè)定調(diào)至pH值6.8。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000），C18柱（Thermo Hypersil BDS，250 mm×4.6 mm，5μm），泵（LPG-3400），紫外檢測(cè)器（VWD-3400），采用變色龍軟件采集并處理數(shù)據(jù)；粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)Z102型）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Scientifc，1510型）；pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，F(xiàn)E28型）。

1.3 HPLC檢測(cè)條件

流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（0.4%磷酸）＝55∶45；流速：1 mL/min；洗脫方式：等度洗脫；柱溫：25℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：20μL［9］。

1.4 方法

1.4.1 供試樣品制備

參照吳柳春等［10］方法并略做修改。將黃麻葉洗凈，50℃烘干，粉碎，過45目篩；精確稱取1.0 g黃麻葉粉末于250 mL圓底燒瓶中，加入甲醇40mL、鹽酸4mL，置于85℃回流水解1.5 h后，冷卻至室溫；再移入離心管于4500 r/min離心10 min，除去沉淀，收集得到的上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，即得水解液，同時(shí)設(shè)置CK（甲醇-鹽酸溶液）對(duì)照。

1.4.2 總黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇溶液溶解后定容于50 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；同時(shí)適度稀釋成不同濃度溶液用作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定［11］。

取1mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10mL的容量瓶中，分別加5% NaNO2溶液0.30mL，搖勻，靜置6min；再加10% Al（NO3）3溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；然后再加4% NaOH溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，于510 nm處測(cè)吸光度［11］。

樣品總黃酮含量測(cè)定方法同上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測(cè)定。

總黃酮質(zhì)量濃度ρ0（mg/mL）按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性回歸方程進(jìn)行計(jì)算。

總黃酮含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w0計(jì)，數(shù)值以毫克每克（mg/g）表示，按公式（1）計(jì)算：

式中：ρ0為總黃酮濃度（mg/mL）；n為樣品稀釋倍數(shù)；v為總體積（mL）；m0為粉末質(zhì)量（g）。

1.4.3 黃酮醇類組分測(cè)定

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：準(zhǔn)確稱取異槲皮素5.0 mg、楊梅素4.2 mg、槲皮素4.5 mg、山奈酚3.6 mg、異鼠李素3.0 mg混合，甲醇溶液超聲溶解，定容至50 mL，0.45μm濾膜過濾。同時(shí)適度稀釋成不同濃度溶液用作HPLC檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線建立線性回歸方程。

樣品：取1 mL提取液用0.45μm濾膜過濾，用作HPLC檢測(cè)。

組分質(zhì)量濃度ρ1（mg/mL）按組分標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性回歸方程進(jìn)行計(jì)算。

組分含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1計(jì)，數(shù)值以毫克每克（mg/g）表示，按公式（2）計(jì)算：

式中：m0為粉末質(zhì)量（g）；ρ1為組分質(zhì)量濃度（mg/mL）；v為總體積（mL）。

1.4.4 酪氨酸酶活性抑制測(cè)定

參照錢文濤［12］方法并略做修改。按表1取樣混勻，37℃恒溫10min后，在T2、T4中分別加入酪氨酸酶，再反應(yīng)10 min，475 nm處測(cè)吸光度，同時(shí)以CK（甲醇-鹽酸溶液）、Vc（黑色素抑制劑）作為對(duì)照。

表1 酪氨酸酶活性抑制率測(cè)定Table 1 Tyrosinase-inhibiting activities assay

酪氨酸酶活性抑制率以φ計(jì)，數(shù)值以百分率（%）表示，按式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：AT1為未加樣品和未加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度；AT2為未加樣品和加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度；AT3為加樣品和未加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度；AT4為加樣品和加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度。

1.4.5 IC50值

IC50值是指酪氨酸酶活性抑制率為50%時(shí)所需樣品的濃度，該值根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得出。IC50值越低，表明酪氨酸酶活性抑制能力越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均取平行3次測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時(shí)采用Excel、SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件和Origin 2020b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量

采用Al（NO3）3顯色法對(duì)不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為y＝1.182 2x+0.090 4，R2＝0.999 2。根據(jù)線性回歸方程和公式得出（表2）：黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉的水解液中總黃酮含量分別為92.76、35.51、37.36 mg/g。結(jié)果表明，3種黃麻葉中總黃酮含量存在差異。

表2 黃麻葉水解液中總黃酮含量測(cè)定Table 2 Determination of flavones in hydrolysate of jute leaves

2.2 黃酮醇類組分與含量

2.2.1 黃酮醇類組分

將5種黃酮醇類組分混合溶解，定容，稀釋至適宜倍數(shù)，HPLC法檢測(cè)。以濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，制作線性回歸方程（表3）。

表3 黃酮醇組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 3 The linear regression equation，relative coefficient and linearity range of flavonols

樣品經(jīng)干燥、粉碎、水解、HPLC法檢測(cè)，對(duì)照黃酮醇類組分標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（圖1）分析可知：3種黃麻葉水解液中均含有異槲皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素以及2種主要未知組分等黃酮醇類組分。

2.2.2 黃酮醇類組分含量

由圖1、表4所示，按照黃酮醇類組分混合標(biāo)準(zhǔn)品曲線繪制的線性回歸方程及公式計(jì)算得出：黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉水解液中黃酮醇類組分含量均以山奈酚最高，其次為異鼠李素。黃德深紅皮葉中的山奈酚和異鼠李素含量分別是巴麻72-3的1.37倍和1.24倍；中黃麻4號(hào)葉中黃酮醇組分含量最高的為槲皮素（2.45 mg/g），其次為山奈酚（0.36 mg/g），最低的為異槲皮素（0.09 mg/g）；同時(shí)可以看出，中黃麻4號(hào)的槲皮素含量分別是黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉的4.38倍、8.75倍。結(jié)果表明，3種黃麻葉均含有黃酮醇類物質(zhì)，且各組分的含量差異顯著。

圖1 黃麻葉水解液中黃酮醇類組分色譜圖Fig.1 Chromatograms of flavonols in hydrolysates of jute leaves

表4 黃麻葉水解液中黃酮醇類組分含量測(cè)定Table 4 Determination of flavonols in hydrolysate of jute leaves

2.3 酪氨酸酶活性抑制

由圖2可知，黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉水解液黃酮對(duì)酪氨酸酶活性抑制率均隨濃度的增加而增大，黃德深紅皮葉抑制率最高。當(dāng)水解液黃酮濃度為10 mg/mL時(shí)，黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉的酪氨酸酶活性抑制率分別達(dá)到90.37%、86.29%、82.38%，而CK（甲醇-鹽酸溶液）雖然對(duì)其也存在一定程度的抑制作用，但相比黃麻葉的抑制率還相當(dāng)?shù)汀?/p>

由表5可看出，黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉水解液黃酮對(duì)酪氨酸酶活性抑制的IC50值分別為4.24、5.04、5.67 mg/mL，即黃德深紅皮葉活性抑制能力最強(qiáng)。結(jié)果表明，3種黃麻葉水解產(chǎn)物黃酮化合物（包括黃酮醇類物質(zhì)）具有明顯地抑制酪氨酸酶活性作用，但與Vc（黑色素抑制劑）相比，其抑制能力均還較弱。

表5 黃麻葉水解液中黃酮抑制酪氨酸酶活性IC50值比較Table 5 Comparison of IC50 values of tyrosinase-inhibiting activities of flavones in hydrolysate of jute leaves

3 結(jié)論與討論

本研究是對(duì)3個(gè)不同品種黃麻葉（苗后天數(shù)均為28 d）利用甲醇-鹽酸溶液在85℃加熱、回流1.5 h條件下進(jìn)行水解，采用Al（NO3）3顯色法測(cè)得黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉的水解液中總黃酮含量分別為92.76、35.51、37.36 mg/g；HPLC法檢測(cè)得到黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉的水解液中均含有異槲皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚及異鼠李素等黃酮醇類組分，其中黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉水解液中以山奈酚為主要黃酮醇類成分，含量分別為1.38、1.01 mg/g；中黃麻4號(hào)葉的水解液中則是以槲皮素（2.45 mg/g）為主要黃酮醇類成分。結(jié)果表明，3種黃麻葉均含有較豐富的黃酮類化合物。

作為黃酮類化合物，許多研究均表明其具有較強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性能力，如：李娜［13］研究了紅花黃酮類化合物（醇提-微波法提?。舛葹? mg/mL時(shí)，對(duì)酪氨酸酶抑制率為63.5%；潘維等［14］分析了槐豆黃酮提取物（堿提-微波法提?。舛葹?.46 g/L時(shí)，對(duì)酪氨酸酶抑制率為77.40%；寧亞萍等［15］報(bào)道了山杏花總黃酮（乙醇-閃式法提?。㊣C50為2.24～3.08 mg/mL。本研究（水解法提?。┙Y(jié)果顯示，3種黃麻葉對(duì)酪氨酸酶活性抑制能力均隨水解液黃酮濃度增加而增大，當(dāng)水解液黃酮濃度為10 mg/mL時(shí)，黃德深紅皮葉、巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉抑制率分別達(dá)到90.37%、86.29%、82.38%，且 IC50值相應(yīng)分別為 4.24、5.04、5.67 mg/mL。與文獻(xiàn)［13-15］相比，當(dāng)黃德深紅皮葉水解液黃酮濃度為8.46 g/L時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶活性抑制率（可達(dá)81.23%）高于槐豆黃酮提取物，低于紅花和槐豆黃酮提取物，而巴麻72-3葉、中黃麻4號(hào)葉其抑制率均稍低于上述文獻(xiàn)報(bào)道。通過比較發(fā)現(xiàn)，3種黃麻葉水解液中含有的黃酮類化合物均對(duì)酪氨酸酶活性存在一定的抑制作用。因此，黃麻葉具有廣闊的深加工開發(fā)前景。

在本研究條件下，水解液中總黃酮含量大小排序?yàn)辄S德深紅皮葉＞中黃麻4號(hào)葉＞巴麻72-3葉，而酪氨酸酶活性抑制強(qiáng)弱、黃酮醇類組分中的山奈酚及異鼠李素含量多少排序均為黃德深紅皮葉＞巴麻72-3葉＞中黃麻4號(hào)葉，由此表明，總黃酮含量高的黃麻葉并不一定對(duì)酪氨酸酶的抑制作用強(qiáng)，并且這一結(jié)果提示酪氨酸酶活性抑制能力可能與水解產(chǎn)物中黃酮醇類某些組分含量多少有關(guān)，從中推斷，黃麻葉中的黃酮醇類組分中的山奈酚也許是酪氨酸酶活性抑制的主要成分之一，這一結(jié)論與文獻(xiàn)［16-17］報(bào)道相吻合。然而，從黃酮醇類組分色譜圖分析中發(fā)現(xiàn)，不同品種黃麻葉水解產(chǎn)物中出現(xiàn)2種未知組分，其峰面積（含量）大于已知5種組分，至于這2種未知組分是否屬于黃麻葉中的黃酮醇類組分或者與酪氨酸酶抑制能力存在著直接關(guān)聯(lián)抑或協(xié)同作用，還有待于進(jìn)一步探討。