蓋草能在胡麻種植中的安全施用及其靶標基因AccA的表達分析

趙麗蓉，李雯，張建平*，劉自剛，齊燕妮，李聞娟，謝亞萍

（1.甘肅農業(yè)大學農學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質資源創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農業(yè)科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070）

胡麻（Linumu usitatissimum L.）屬于亞麻科亞麻屬，自花授粉，是一年生草本植物（2n＝2x＝30）。胡麻作為我國西北和華北地區(qū)主要的油料及經濟作物，具有耐旱、耐寒、耐瘠薄等特點［1-2］。

雜草防除是胡麻種植工作中的一個重要環(huán)節(jié)，雜草若不及時除掉很容易形成草荒，造成減產。胡麻多采用窄行密植栽培，而且生育期雜草種類多、數量大，難以進行中耕除草，且人工除草成本高、費時費力。近年來化學除草劑已經在胡麻種植中得到廣泛應用，對胡麻的高產穩(wěn)產起到了巨大的作用［3］。使用除草劑對雜草進行化學防治，具有高效、經濟、省力等優(yōu)點。在實際生產中，人們往往關注的是除草劑的除草效果，而忽視了其對作物的危害，若除草劑使用濃度和方法不當，會使作物產生藥害，造成嚴重的經濟損失［4-5］。

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑具有高效低毒、施用期長、對后茬作物安全等優(yōu)點，其作用原理是通過抑制ACCase的羧化反應，使植物脂肪酸合成受到抑制，導致細胞膜的完整性遭到破壞，造成相關代謝產物滲漏，最終導致植物死亡［6］。蓋草能屬于ACCase抑制劑類除草劑，對禾本科雜草具有極強的防效功能，在全世界范圍內廣泛使用。在我國，高效蓋草能已有多年的使用歷史，主要用于油菜、棉花、大豆、油葵、紅花、甜菜、亞麻、瓜類、苜蓿、甘草、胡蘿卜、蔥、蒜、薯類、蔬菜等多種闊葉作物［7］。雖然對其產生抗性的雜草至今尚未有相關的報道，但長期單一使用，會導致雜草對蓋草能的敏感性逐漸下降，而除草劑用量的加大會對作物生長發(fā)育造成一定的影響［8］。胡麻是雙子葉植物，具有異質型ACCase，對蓋草能有一定的抗性。本研究采用蓋草能對隴亞14號進行處理，評價蓋草能不同處理下隴亞14號的安全性，結合蓋草能靶標基因AccA的表達，旨在為科學合理使用蓋草能提供理論依據，為進一步培育抗蓋草能胡麻種質資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試胡麻品種隴亞14號由甘肅省農業(yè)科學院作物研究所胡麻課題組提供。供試材料于2021年3月種植于甘肅省農業(yè)科學院蘭州試驗基地（36°03′N，103°40′E，海拔1500m），出苗后30 d對胡麻幼苗進行蓋草能處理。

1.2 蓋草能處理與樣品采集

供試藥劑為10.8%蓋草能乳油（高效氟吡甲禾靈），美國陶氏益農公司生產。配制3種不同濃度的蓋草能藥劑（5、10、15 mL/L），用3種濃度的蓋草能分別對隴亞14號幼苗進行噴霧處理，每種濃度均勻噴霧一次，用量為80 mL。蓋草能處理的同時取未施藥的隴亞14號葉片作為對照，在蓋草能處理后3 h、6 h、24 h、7 d分別采集3種不同濃度處理的隴亞14號葉片，所有采取的樣品用液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 組織樣總RNA提取及cDNA合成

用試劑盒Plant Easy Spin RNAMiniprep Kit（BIOMIGA，USA）提取各樣品RNA，隨后利用NanoDrop 2000分光光度計和凝膠電泳對RNA的濃度和純度進行檢測。用試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kitwith gDNA Eraser（Perfect Real Time；TaKaRa）去除基因組DNA并合成cDNA，檢測其濃度和質量后保存于-20℃冰箱用于qRT-PCR分析。

1.4 實時熒光定量PCR

根據胡麻AccA基因CDS序列，利用Primer 5.0軟件設計熒光定量引物（表1）。以GAPDH為內參基因，使用2×SYBR Mixture（Biomiga）熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR。PCR反應體系為20μL：2×SYBR Mixture 10μL、正向引物（10μmol/L）1μL、反向引物（10μmol/L）1μL、cDNA模板（100 ng/μL）2μL、無 RNase水 6μL。PCR反應條件：50℃ 2 min、95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃15 s、72℃ 15 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s、65℃ 1min、97℃ 1 s。每個樣品3次重復。運用2-ΔΔCt方法計算目標基因的相對表達量［9］，最后利用Microsoft Excel 2019軟件作圖。

表1 熒光定量引物Table 1 Fluorescent quantitative primers

2 結果與分析

2.1 蓋草能處理對胡麻幼苗的影響

施用蓋草能后分別在3 h、6 h、24 h和7 d觀察不同處理下胡麻幼苗的形態(tài)變化，發(fā)現不同處理的蓋草能對胡麻幼苗的損傷程度隨時間發(fā)生不同程度的變化（圖1）。與對照相比，施藥3 h后，噴施5 mL/L蓋草能的胡麻幼苗少量葉片出現模糊的條狀淺斑，植株整體未出現萎蔫，莖部正常，未發(fā)生藥害，生長狀況良好；噴施10 mL/L蓋草能時多數葉片發(fā)生藥害，出現條狀淺斑，葉片無萎蔫干枯，植株莖部下段發(fā)生輕微藥害，植株總體生長狀態(tài)良好；噴施15 mL/L蓋草能的植株葉片多數出現深色藥害斑塊，少數下部葉片變黃，莖下部出現輕微藥害，有淺色條斑但并不明顯，生長狀態(tài)良好。施藥6 h后，噴施5 mL/L和10 mL/L蓋草能時少量植株藥害加強，葉片表面斑塊顏色加深，但整體葉片顏色仍保持綠色，生長未受到明顯影響，與施藥3 h的表現無明顯差異；噴施15 mL/L蓋草能時植株多數葉片尖部出現干枯，葉片表面藥害條斑擴散為片狀，少數葉片甚至出現萎蔫，蜷縮。施藥24 h后，噴施5 mL/L蓋草能的植株少數葉片藥害減輕，葉片表面的條狀淺斑部分消失，植株進入藥害恢復階段；噴施10 mL/L蓋草能的植株少數葉片表面藥害形成的條斑由1條增至2～3條，極少數矮小植株頂部葉片大面積受到藥害，莖部條斑顏色明顯加深；噴施15 mL/L的植株葉片絕大多數發(fā)生藥害，多數葉片干枯蜷縮，植株萎蔫嚴重，莖部整體受損嚴重，出現褐色片狀斑。施藥7 d后，噴施5 mL/L蓋草能的植株已完全恢復正常生長，與對照無明顯差別；噴施10 mL/L蓋草能的植株少數葉片仍有干枯，但植株莖部基本恢復正常，藥害有明顯緩解，植株進入恢復階段；噴施15 mL/L蓋草能的植株部分葉片干枯發(fā)黃，植株莖部藥害斑減輕減少，藥害植株僅有輕微的恢復。與對照相比，噴施5 mL/L蓋草能的胡麻植株恢復后與對照無明顯差異，噴施15 mL/L蓋草能的胡麻植株受藥害較為嚴重，而噴施10 mL/L蓋草對植株雖有藥害但基本可以恢復正常生長。對處理后不同時間的植株高度分析發(fā)現（圖2），噴施15 mL/L蓋草能藥劑的植株較其他兩個處理矮。

圖1 蓋草能不同處理后胡麻幼苗形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of flax seedlings after spraying different treatments of haloxyfop-r-methyl

圖2 蓋草能不同處理后植株株高Fig.2 Plant height of flax under different treatments of haloxyfop-r-methyl

2.2 蓋草能處理后植株的枯萎率

對3種不同濃度蓋草能處理下植株的枯萎率進行分析（圖3），結果表明，5 mL/L蓋草能處理下，其在各時段枯萎率均為0，說明在此濃度下，植株生長狀況良好，無枯萎植株；10 mL/L蓋草能處理下，隨著時間變化植株枯萎率呈先增后減趨勢，分別為0、10%、30%、25%，說明在此濃度下，植株前期受藥害嚴重導致枯萎植株增加，在處理后7 d，部分枯萎植株恢復正常生長，植株整體進入恢復階段；15 mL/L蓋草能處理下，植株枯萎率持續(xù)增長，分別為0、15%、45%、60%，說明植株一直處于藥害階段，難以恢復正常生長。

圖3 蓋草能不同處理后植株枯萎率Fig.3 The withering rate of plants after spraying different treatments of haloxyfop-r-methyl

2.3 蓋草能脅迫下AccA基因表達分析

在蓋草能處理后不同時期采集葉片，通過qRT-PCR分析其靶標基因AccA的表達模式。由圖4可知，AccA在所采集的13個樣品中均有表達，且在噴施15 mL/L蓋草能后24 h的葉片中表達量明顯高于其他處理的葉片。隨著時間的變化，AccA的表達量總體呈先增后減的趨勢，且均在處理后24 h時表達量達到最高。在蓋草能處理后6 h和24 h時，AccA基因表達量因蓋草能濃度不同而不同，呈現為 15 mL/L＞10 mL/L＞5 mL/L，均在噴施 15 mL/L時表達量最高，且 24 h時表達量差異更加顯著。

圖4 蓋草能脅迫下AccA基因的表達分析Fig.4 Expression analysis of AccA under haloxyfop-r-methyl stress

2.4 相關性分析

相關性分析結果表明，藥劑濃度與植株枯萎率呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.624；處理時間與株高呈極顯著正相關（p＜0.01），相關系數為0.963；其余各性狀間不相關或是相關性不顯著（表 2）。

表2 相關性分析Table 2 Correlation analysis

續(xù)表2

3 討論

雜草對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成嚴重威脅［10］。有研究［11-12］表明，施用化學除草劑可以有效抑制雜草生長，從而提高作物的產量，但化學除草劑對于作物而言是一種脅迫因子，過量施用也會導致作物生長緩慢甚至死亡。蓋草能是一種選擇性殺滅有害草類的除草劑，能被葉片吸收并運輸至整個植株，安全性高，已被廣泛應用于油菜、棉花等作物除草工作中［13-15］，但在胡麻中相關研究較少?；诖吮狙芯繉ιw草能在胡麻田中的安全應用及其靶標基因的表達模式進行了相關研究。

蓋草能屬于ACCase抑制劑類除草劑，胡麻具有異質型ACCase，對其有一定的抗性。蓋草能靶標基因AccA的表達量可以反映植株對蓋草能的敏感度。本研究發(fā)現蓋草能脅迫處理下，AccA基因在胡麻葉片中的表達量隨時間變化呈現出先增后減的趨勢。同時還發(fā)現，適量施用蓋草能對胡麻植株沒有明顯的藥害影響，植株會恢復正常生長；過量噴施會抑制胡麻生長發(fā)育，對胡麻的生長有明顯的藥害，表現為葉色失綠，葉片萎蔫，莖葉出現不同程度藥害斑等，植株矮小，而且難以恢復正常生長，這與前人研究結果一致［12］。另外，對處理植株進行枯萎率及相關分析發(fā)現，藥劑濃度越高，植株枯萎率越高，二者之間呈顯著正相關（p＜0.05），處理時間與株高呈極顯著正相關（p＜0.01）。

本研究旨在研究不同濃度蓋草能處理下胡麻植株的生長狀況及其靶標基因AccA的表達模式，結合相關性分析，為胡麻種植中科學合理使用蓋草能提供理論依據，從而為進一步培育抗蓋草能胡麻種質資源奠定基礎。

4 結論

胡麻幼苗經蓋草能處理后，隨著時間的變化植株出現了不同程度的藥害現象，且噴施蓋草能濃度越大藥害越嚴重，植株較矮小，噴施10 mL/L蓋草能對胡麻植株相對安全，植株可以恢復正常生長，與對照植株無明顯差異；AccA基因作為蓋草能靶標基因，其表達量隨時間變化呈現先增后減的趨勢，且在施藥24 h后達到最高；藥劑濃度與植株枯萎率呈顯著正相關（p＜0.05），處理時間與株高呈極顯著正相關（p＜0.01）。