基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接預(yù)測金雀花降血壓的活性成分及作用機制

布比阿加爾·哈依拉提，李 洋，秦亞迪，姚 軍，程煜鳳，沈 靜

（新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，2第五附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 830011）

金雀花（Caragana sinica）為豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物錦雞兒的成熟干燥花[1]，主要化學(xué)成分為黃酮、生物堿、萜類、甾醇等化合物[2]。金雀花已有多年用藥歷史，主要用于肺虛久咳、多血癥以及高血壓等多種疾病的治療[3-4]。本課題組前期研究證實金雀花對腎性高血壓大鼠有較好地降壓作用[4]，但對其降壓物質(zhì)基礎(chǔ)及機制尚未有研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個集系統(tǒng)生物學(xué)、信息科學(xué)以及藥理學(xué)的新興研究領(lǐng)域，可以可視化化合物與靶點之間復(fù)雜的相互作用，以推進(jìn)藥物的研發(fā)[5]。分子對接是通過計算機模擬分子間相互識別，空間匹配和能量匹配過程的一種計算機技術(shù)。中藥化學(xué)成分復(fù)雜，其中的多種有效成分和多個靶點相互作用發(fā)揮藥效，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性、全面性與中醫(yī)藥辯證論、整體觀等觀念基本一致，結(jié)合分子對接技術(shù)進(jìn)行初步驗證，可以很好的解釋中藥通過多種途徑產(chǎn)生藥理作用，為中醫(yī)藥的研究提供了新的思路。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究金雀花降血壓的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 金雀花活性成分的篩選通過檢索CNKI、萬方、維普及TCMSP 等數(shù)據(jù)庫對金雀花的化學(xué)成分進(jìn)行收集，將其依次輸入Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到化學(xué)結(jié)構(gòu)，再通過ChemDram軟件畫出化合物SDF 結(jié)構(gòu)，將其輸入Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫（http://old.swissadme.ch/），在顯示的報告中，以“GI absorption:High”且“Lipinski:Yes,0 violation”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫中“GI absorption”參數(shù)代表胃腸道吸收，“Lipinski”參數(shù)根據(jù)Lipinski類藥5原則[6-7]，即根據(jù)小分子：（1）鍵供給數(shù)；（2）相對分子質(zhì)量；（3）脂水分配系數(shù)logP；（4）氫鍵受體數(shù)目；（5）可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目等參數(shù)綜合考量小分子類藥性，最終選擇胃腸道吸收性較好，且類藥性較好的化合物為金雀花降血壓活性成分。

1.2 金雀花活性成分的靶點預(yù)測將篩選出的金雀花化學(xué)成分依次輸進(jìn)Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://old.swisstargetprediction,ch/），獲取化合物相關(guān)的預(yù)測靶點，將得到的靶點通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/uniprot/）進(jìn)行勘正，再經(jīng) Uniprot 進(jìn)行檢索時應(yīng)選擇Reviewed（已證明）和Human（人）物種來進(jìn)行準(zhǔn)確校準(zhǔn)，獲得金雀花活性成分的靶點。

1.3 高血壓靶點的收集通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://genecards.org），以“Hypertension”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance score）≥10 為條件選出相關(guān)性高的靶點，經(jīng)過去重、合并后收集得到高血壓相關(guān)靶點。

1.4 金雀花-高血壓交集靶點的獲取將篩選出的金雀花預(yù)測靶點和收集的高血壓靶點輸入Venny2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)制得韋恩圖，得到交集基因，獲取金雀花活性成分降血壓的潛在靶點。

1.5“金雀花-成分-高血壓-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制將金雀花活性成分的靶點以及高血壓的靶點導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 軟件，制作“金雀花-化學(xué)成分-高血壓-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 蛋白-疾病互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將金雀花有效成分和高血壓共同靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl），限制物種為人，隱去游離點，設(shè)定最小相互作用分?jǐn)?shù)為0.4，得到關(guān)鍵作用靶點，再將關(guān)鍵作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到金雀花有效成分靶點蛋白-高血壓靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 生物通路分析與功能富集分析將金雀花活性成分和高血壓交集靶點導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/），物種選擇“sapiens”，作KEGG 通路分析和GO生物富集分析，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)繪制KEGG氣泡圖和3種GO分析的柱狀圖，以及利用KEGG Mapper工具繪制靶點通路圖并對得到的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.8 分子對接的方法將經(jīng)過篩選得到的8種金雀花化學(xué)成分和得到的前8個核心靶點進(jìn)行分子對接，將降壓藥卡托普利作為陽性對照藥。金雀花化學(xué)成分及陽性藥的分子結(jié)構(gòu)從TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.nc-bi.nih.gov/）和 Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行下載，核心靶點的分子結(jié)構(gòu)則從PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中進(jìn)行下載,將下載好的靶點蛋白質(zhì)導(dǎo)入Pymol 軟件進(jìn)行去水，去配體等前處理，再將其與下載好的金雀花化學(xué)成分及陽性藥的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入Auto Dock Tool軟件進(jìn)行半柔性分子對接，對接采用blind docking 的對接方法，即Grid box 完全包裹住靶點蛋白。對接次數(shù)設(shè)定為50次，其余參數(shù)默認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 金雀花活性成分篩選結(jié)果以“金雀花”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)文獻(xiàn)及TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共獲得21 種化學(xué)成分，見表1；將這21 種化學(xué)成分導(dǎo)入Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行篩選，共選出8種化合物滿足胃腸道吸收性較好且類藥性較好的限定條件，故將其定為本研究中金雀花活性成分，見表2。

表1 金雀花化學(xué)成分篩選結(jié)果

表2 金雀花活性成分篩選結(jié)果

2.2 金雀花活性成分靶點篩選結(jié)果將篩選出的金雀花活性成分依次輸進(jìn)Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，獲取化合物相關(guān)預(yù)測靶點，再將得到的靶點通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行勘正，共得到了192 個金雀花活性成分靶點。

2.3 高血壓靶點篩選結(jié)果在GeneCards 數(shù)據(jù)庫以“Hypertension”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance score）≥10 為條件進(jìn)行篩選，去重后共得到3 323個與高血壓相關(guān)的靶點。

2.4 金雀花-高血壓交集靶點篩選結(jié)果將得到的高血壓相關(guān)靶點和金雀花活性成分靶點通過在線繪圖軟件取得交集，得到高血壓靶點2 996 個約占總靶點數(shù)的94%，得到金雀花靶點60 個約占總靶點數(shù)的1.9%，得到金雀花-高血壓交集靶點132 個約占總靶點數(shù)的4.1%，并繪制金雀花-高血壓韋恩圖，見圖1。

圖1 金雀花化學(xué)成分靶點與高血壓靶點Venn圖

2.5“金雀花-成分-靶點-高血壓”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制通過Cytoscape 軟件對選出的132 個交集靶點以及對應(yīng)的8 種活性成分作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），得到142個節(jié)點，655 個連線，在圖中八邊形表示金雀花，六邊形表示金雀花8 種活性成分，菱形表示靶點，圓形表示高血壓，圖中一個節(jié)點連接的線的數(shù)量稱為該節(jié)點的度值，度值與對應(yīng)節(jié)點連線的數(shù)量成正比，圖中圖形越大，表明與之連接的節(jié)點越多（見表3），說明其在該網(wǎng)絡(luò)中越重要，可以從網(wǎng)絡(luò)圖中看出金雀花化學(xué)成分7,4'-二羥基黃酮、金合歡素、櫻花素、芫花素、異鼠李素、槲皮素、芹菜素等在金雀花降血壓過程中發(fā)揮重要的作用。

表3 金雀花化學(xué)成分度值信息

圖2 “金雀花-成分-靶點-高血壓”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 蛋白-疾病互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的繪制以及關(guān)鍵靶點將金雀花活性成分與高血壓共同靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到網(wǎng)絡(luò)圖，再對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，計算出度值的平均值為19，將大于19 的所有結(jié)點節(jié)選出來，得到55 個關(guān)鍵靶點，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3；圖形越大，顏色越深說明該靶點越重要。根據(jù)度值排名選出前30個為核心調(diào)控靶點，見圖4。

圖3 金雀花-高血壓PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 金雀花降血壓排名前30的核心調(diào)控靶點

2.7 KEGG 通路分析及GO 富集分析將金雀花活性成分和高血壓交集靶點導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行KEGG 通路分析，共有160 條相關(guān)通路數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)按Count≥10 為條件進(jìn)行篩選，選出51 條符合條件的通路，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，利用R 語言繪制KEGG 通路氣泡圖，見圖5。圖中X 軸代表金雀花活性成分和高血壓交集靶點的富集情況，Y 軸表示與金雀花活性成分相關(guān)的KEGG 通路，圖中氣泡顏色越紅越亮則代表顯著性越高，氣泡面積越大表示匯集在該通路上的靶點越多。由圖可知，金雀花主要是通過癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K-AKT 信號通路（PI3K-AKT signaling pathway）、Ras 信號通路（Ras signaling pathway）、絲裂素活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）等通路發(fā)揮降血壓的作用。KEGG 通路分析結(jié)果表示除了癌癥通路，富集在PI3K-AKT 信號通路的靶點最多，有25 個。通過繪制PI3K-AKT 信號通路圖，見圖6?？梢钥闯鼋鹑富ɑ瘜W(xué)成分是通過作用于多個靶點多條通路發(fā)揮降血壓作用。在Metascape 數(shù)據(jù)庫中選擇 GO-BP、GO-CC、GO-MF 3種GO 富集分析，分別得到319條BP通路，30個CC過程，以及23 個MF 功能。按-LogQ 值的升序排序，選出前20 個GO 注釋，將其繪制成柱狀圖（見圖7）。由圖可見，GO注釋多與BP和MF相關(guān)，如磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、蛋白質(zhì)磷酸化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

圖5 交集靶點KEGG通路富集分析

圖6 金雀花化學(xué)成分靶點在PI3K-AKT信號通路的分布圖

圖7 金雀花-高血壓交集靶點GO分析

2.8 金雀花-高血壓分子對接從排名前30 的靶點中，選取度值最大的前8 個靶點做分子對接，見表4。將8 個金雀花活性成分以及陽性藥卡托普利（Compound CID:44093;CAS:62571-86-2）的分子結(jié)構(gòu)文件和經(jīng)過前處理的靶點蛋白進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果均小于0 kcal/mol，說明配體和受體能自發(fā)結(jié)合；對接結(jié)果小于-4.0 kcal/mol，說明配體和受體之間有較好的結(jié)合活性；對接結(jié)果小于-7.0 kcal/mol，說明配體和受體具有較強的結(jié)合活性。對8 個金雀花活性成分及1 個陽性藥分子與8 個靶點蛋白對接的最低結(jié)合能作熱圖（如圖8），其中橫坐標(biāo)表示靶點蛋白，縱坐標(biāo)表示金雀花活性成分，顏色越深表示最低結(jié)合能越小。如圖所示所有分子和靶點蛋白的最低結(jié)合能均小于0 kcal/mol，說明金雀花活性成分和靶點都能自發(fā)結(jié)合。最低結(jié)合能越小表明分子和靶點結(jié)合越好，如7,4'-二羥基黃酮和EGFR 最低結(jié)合能為-8.0 kcal/mol，說明7,4'-二羥基黃酮和EGFR 不僅能自發(fā)結(jié)合，且兩者具有較強的結(jié)合活性，能較好結(jié)合從而發(fā)揮藥理作用。對接結(jié)果表明，金雀花活性成分的最低結(jié)合能均小于陽性藥卡托普利，說明金雀花這8個活性成分與這些靶點的結(jié)合活性均強于卡托普利。選取結(jié)合活性較強的芹菜素與AKT1、兒茶素與AKT1，7,4'-二羥基黃酮與EGFR借助Pymal軟件分別進(jìn)行分子對接以及結(jié)合位點局部放大可視化，可更直觀的表示金雀花活性成分與靶點的結(jié)合情況，見圖9。由圖9A 可知，兒茶素和AKT1 的CLU-278、ASN-279、LEU-295、TYR-229 4 殘基形成了 7 個氫鍵，且氫鍵長度分別為2.0、2.5、2.1、2.2、2.8、1.9、1.9。

圖9 分子對接模式圖

表4 度值排名前8的靶點信息

3 討論

通過本研究發(fā)現(xiàn)金雀花降血壓作用涉及金雀花中多種活性成分，如兒茶素、7,4'-二羥基黃酮、櫻花素等，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這些成分在一定程度上通過不同機制能起到降血壓作用，如兒茶素通過抑制MAPKs信號通路發(fā)揮降壓作用[8]。通過PPI靶點網(wǎng)絡(luò)和GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)金雀花降血壓網(wǎng)絡(luò)涵蓋了多個與高血壓疾病相關(guān)的靶點、生物過程、分子功能、疾病通路、信號通路等,如蛋白激酶1（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）等蛋白靶點，如磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras 信號通路（Ras signaling pathway）、絲裂素活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）等信號通路，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這些靶點和通路在一定程度上都與高血壓相關(guān)[9-12]。如AKT1 通過刺激內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化，生成NO，產(chǎn)生擴血管作用，從而起到降血壓作用[13]，VEGF 通過促進(jìn)NO 介導(dǎo)的血管舒張來影響血壓[14]。如研究PI3K/Akt信號通路發(fā)現(xiàn)，通過該通路可激活eNOS 的磷酸化，eNOS 催化血管中NO 的合成，從而起到降血壓作用[15]。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的表型轉(zhuǎn)換會影響包括高血壓在內(nèi)的心血管疾病的發(fā)展，而最近有研究表明VSMCs 的表型轉(zhuǎn)換受Akt 和MAPK 信號之間平衡的調(diào)節(jié)，說明MAPK信號在高血壓發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[16]。有研究表明Rap1 被剪切應(yīng)力激活，促進(jìn)內(nèi)皮機械傳感復(fù)合物整合素和鈣黏蛋白的形成，促進(jìn)NO 的生成，該研究說明Rap1 信號通路在心血管疾病中具有廣泛的影響[17]。

本研究通過分子對接實驗初步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的8個活性成分與度值較高的前8 個高血壓相關(guān)靶點具有較強的結(jié)合活性，表明金雀花可通過多種成分、多個靶點、多條通路發(fā)揮降血壓作用，為深入研究其具體作用機制提供了基礎(chǔ)。