基于GC-MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)毛菊苣籽揮發(fā)油抗AD作用機(jī)制的研究

雷 毅，葉銀松，馬曉麗,2，米 娜，康金森,2，楊 建,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011，2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000，3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊830054)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要采用聯(lián)合用藥治療以減輕患者癥狀，延緩病情發(fā)展[1]。所使用膽堿酯酶抑制如：多奈哌齊、石杉?jí)A甲等，這些藥物能在一定程度上改善癥狀，但不能延緩AD 患者的發(fā)病進(jìn)程，同時(shí)還伴有惡心、嘔吐等不良反應(yīng)，因此，研發(fā)緩解或治療AD 的藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[2-3]。毛菊苣（Cichorum glandulosumBoiss.et Huet)為菊科菊苣屬植物，屬于藥食兩用植物[4]。毛菊苣籽揮發(fā)油的主要成分為萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)等活性成分，具有保肝、降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化抗炎、抗菌等多種藥理作用[5]。目前，毛菊苣已應(yīng)用于食品、藥品行業(yè)。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[6]分析毛菊苣的主要成分，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)抗AD 的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行快速篩選，以探究毛菊苣籽揮發(fā)油抗AD的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器Waters Quattro Micro GC 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；HLD-10002型電子天平(杭州友恒稱(chēng)重設(shè)備有限公司)；揮發(fā)油提取器；超純水由Milli-Q純水器制備。

1.2 試藥乙酸乙酯(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；毛菊苣種子2021年3月購(gòu)買(mǎi)于新疆和田地區(qū)藥材市場(chǎng)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授鑒定為毛菊苣（Cichorum glandulosumBoiss.et Huet)的成熟干燥種子。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，http://www.omim.org/)；治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[7](TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；人類(lèi)基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，http://www.genecards.org/)；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(www.swisstargetprediction.ch)；STITCH(http://stitch.embl.de)；ChemMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lilab-ecust.cn/chemmapper/index.html)；UniProt 數(shù) 據(jù) 庫(kù) (http://www.uniprot.org/)；STRING 平臺(tái)(https://string-db.org/)；Venny2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；DAVID6.8生物信息資源網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)；微生信數(shù)據(jù)可視化在線(xiàn)繪圖網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析軟件Cytoscpae3.8.1。

1.4 揮發(fā)油成分的測(cè)定

1.4.1 揮發(fā)油的提取 按照《中華人民共和國(guó)藥典》第四部中揮發(fā)油的測(cè)定方法從毛菊苣籽中提取揮發(fā)油[8]。將200 g 菊苣籽放入1 000 mL 圓底燒瓶中，加入700 mL 蒸餾水，浸泡12 h，揮發(fā)油提取器支管內(nèi)加入3 mL 乙酸乙酯和適量蒸餾水，蒸餾提取10 h，記錄乙酸乙酯的體積[9]，打開(kāi)揮發(fā)油提取器的旋塞從下方放出乙酸乙酯層，加入適量無(wú)水硫酸鈉放入冰箱于4 ℃環(huán)境下干燥24 h，使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，再次將其放入冰箱于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件[10]：色譜柱HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30.00 mm×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，采用不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.00 μL，柱流量1.00 mL/min，柱溫初始溫度50 ℃，以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：電離源為離子轟擊源(electron impact, EI)，離子源溫度180 ℃，離子化電壓70 eV，接口溫度:250 ℃，掃描模式:全掃描模式，m/z:45 ～ 500。

1.5 備選化合物潛在靶點(diǎn)的篩選將備選化合物在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到的SMILES代碼導(dǎo)入SwissTarget、STITCH、ChemMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行化合物靶點(diǎn)查找，匯總得到化合物靶點(diǎn)。為了盡可能得到全部疾病靶點(diǎn)，利用 OMIM、TTD、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)以“Alzheimer's disease”和“AD”為檢索詞進(jìn)行疾病相關(guān)靶點(diǎn)檢索，匯總?cè)ブ氐玫郊膊“悬c(diǎn)。將檢索得到的化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入在線(xiàn)網(wǎng)站Venny 2.1.0 中繪制維恩圖進(jìn)行對(duì)比，重疊部分為兩者的交集，篩選出毛菊苣籽揮發(fā)油治療AD 的潛在靶點(diǎn)，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 蛋白(PPI)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[11]將潛在靶點(diǎn)交集導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人(Homo sapiens)，分析蛋白之間相互作用關(guān)系，可得到靶點(diǎn)蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 GO 基因功能與KEGG 通路分析[12]將潛在靶點(diǎn)交集導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 生物過(guò)程(FDR＜ 0.01)與KEGG 通路分析(P＜0.05)，得到其生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能及主要通路等有關(guān)的富集項(xiàng)，將得到的富集數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信網(wǎng)站繪制富集柱狀圖和氣泡圖，得到富集分析的可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 毛菊苣籽揮發(fā)油的GC-MS 分析結(jié)果經(jīng)測(cè)定分析共得到64 個(gè)成分峰，其中3,4,5-三甲基-1,2,4-三唑、1,2-雙[（1 E）-丁-1,3-二烯基]環(huán)丁烷、10,13-十八碳二烯酸甲酯，含量分別為20.44%、4.74%、3.17%，見(jiàn)圖1。根據(jù)GC-MS分析得到的結(jié)果進(jìn)行化合物匹配，共獲得28個(gè)含量＞0.5%的成分，見(jiàn)表1。

圖1 毛菊苣籽揮發(fā)油的GC-MS總離子圖

表1 毛菊苣籽揮發(fā)油的主要成分

2.2 毛菊苣籽揮發(fā)油抗AD 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果將表 1 中的化合物導(dǎo)入 SwissTarget、STITCH、Chem-Mapper 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行靶點(diǎn)查找，取并集后去除重復(fù)值采用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)從其中18 個(gè)化合物共得到185個(gè)靶點(diǎn)；從相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索導(dǎo)出，取并集后去除重復(fù)值并用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化后共得到279個(gè)AD 相關(guān)靶點(diǎn)。將化合物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn 分析得到36 個(gè)交集靶點(diǎn)，交集即為毛菊苣籽揮發(fā)油治療AD 的潛在靶點(diǎn),見(jiàn)圖2。將36 個(gè)交集靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的12 個(gè)化合物導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件繪制化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，每條邊代表潛在活性成分與作用靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)越大代表該化合物度值越大，線(xiàn)條越粗代表節(jié)點(diǎn)間關(guān)聯(lián)性越強(qiáng),見(jiàn)圖3。

圖2 化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

圖3 化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 構(gòu)建蛋白(PPI)互作網(wǎng)絡(luò)將2.1中得到的36個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白來(lái)源設(shè)置為“Homo sapiens”，進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析得到靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系[13]，見(jiàn)圖4。將PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1，根據(jù)度值結(jié)果顯示，度值＞1.591(平均數(shù))的靶點(diǎn)有ESR2、ACHE、KDR、MAOA、CHRM3 等，見(jiàn)表2。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表2 蛋白核心靶點(diǎn)信息

2.4 GO 基因功能分析將36 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 GO 生物過(guò)程分析(FDR＜ 0.01)，共得到24條富集結(jié)果，其中生物過(guò)程(BP)10條，細(xì)胞組成(CC)8 條，分子功能(MF)6 條，見(jiàn)圖5。生物過(guò)程主要涉及化學(xué)突觸傳遞(Chemical synaptic transmission)、血清素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Serotonin receptor signaling pathway)、磷酸脂酰肌醇3-激酶信號(hào)的正調(diào)控(Positive regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)等，細(xì)胞組成主要涉及質(zhì)膜(Plasma membrane)、質(zhì)膜的整體成分(Integral component of plasma membrane)、樹(shù)突(Dendrite)等，分子功能主要涉及藥物的結(jié)合作用(Drug binding)、酶的結(jié)合(Enzyme binding)、G 蛋白偶聯(lián)的血清素受體活性(G-protein coupled serotonin receptor activity)等。

圖5 GO富集分析柱狀圖

2.5 KEGG 通路分析選用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路分析(P＜0.05)，共得到7條信號(hào)通路及涉及的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖6、表3。通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體的相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)通路(Calcium signaling pathway)、血清素能突觸(Serotonergic synapse)、PI3K-Akt信號(hào)通路 (PI3K-Akt signaling pathway)、cAMP 信 號(hào) 通 路(cAMP signaling pathway)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控(Regulation of actin cytoskeleton)、膽堿能突觸(Cholinergic synapse)。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

表3 KEGG通路及涉及的靶點(diǎn)

3 討論

AD 是老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD 屬于“呆病、健忘、虛勞、善忘”等范疇[14]；研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于治療AD具有多角度、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，因此本研究結(jié)合GC-MS 和生信分析技術(shù)初步預(yù)測(cè)了毛菊苣籽揮發(fā)油治療AD 的作用靶點(diǎn)及可能機(jī)制[15-17]。

本次研究通過(guò)GC-MS 分析確定了36 個(gè)AD 的治療靶點(diǎn)，篩選出毛菊苣籽揮發(fā)油防治AD 的15個(gè)潛在核心靶點(diǎn)，其中ESR2 和ACHE 與疾病靶點(diǎn)的相關(guān)度最高。雌激素受體(ESR2)是激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和發(fā)育關(guān)鍵方面的轉(zhuǎn)錄因子，它的核受體（ERβ）參與情感、情緒、行為和認(rèn)知的調(diào)節(jié)，這都對(duì)AD 產(chǎn)生影響。研究表明，ESR2 基因多態(tài)性與AD 晚期發(fā)病有關(guān)，該基因的變異可能改變疾病易感性。ESR2基因內(nèi)含子的遺傳變異可能導(dǎo)致雌激素的神經(jīng)保護(hù)作用降低，并誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元丟失，最終導(dǎo)致AD。AChE是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，廣泛分布于尾狀核、黑質(zhì)、海馬和小腦等神經(jīng)組織。乙酰膽堿酯酶抑制劑可通過(guò)抑制AChE 活性，減少ACh 水解，增加海馬體和大腦皮層區(qū)域的乙酰膽堿(ACh)的水平，由此起到改善AD患者的認(rèn)知功能。

毛菊苣的保肝、降糖、調(diào)節(jié)血脂、抗菌等功效已被現(xiàn)代藥理學(xué)研究所證實(shí)，但目前對(duì)毛菊苣防治AD的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)毛菊苣籽揮發(fā)油的主要成分和對(duì)抗AD 靶點(diǎn)的快速篩選，通過(guò)KEGG 通路分析，富集到毛菊苣籽揮發(fā)油抗AD 的生物通路分別為神經(jīng)活性配體-受體相互作用(13 個(gè)靶點(diǎn))、鈣質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)通路(10 個(gè)靶點(diǎn))、血清素能突觸(9 個(gè)靶點(diǎn))、PI3K-Akt 信號(hào)通路 (7 個(gè)靶點(diǎn))、cAMP 信號(hào)通路(7 個(gè)靶點(diǎn))[18-19]。這些通路均與AD 有密切關(guān)系，可以作為今后毛菊苣揮發(fā)油防治AD 在深入分子層面研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為毛菊苣藥材的廣泛開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。