人宮頸癌干細(xì)胞分離、鑒定及其特性

吳琳琳，張 茹，李 英，熊 川

（武警四川省總隊醫(yī)院1體檢科，2婦科，3軍事醫(yī)學(xué)與特種學(xué)科，四川 樂山 614000）

宮頸癌作為生殖道惡性腫瘤之一，死亡率較高，占全部惡性腫瘤總死亡人數(shù)的3.26%[1]，其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌所占比重最高，為75%～80%[2]。為更好地研究宮頸癌和建立宮頸癌細(xì)胞系平臺，探討有效的分離、培養(yǎng)和監(jiān)測原代宮頸癌干細(xì)胞的方法具有十分重要的臨床價值[3]。目前臨床上對宮頸癌的治療取得了一定的進(jìn)展，然而腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等會增加治療失敗率，是引起患者死亡的重要因素。有數(shù)據(jù)顯示，宮頸癌手術(shù)患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險為40%，這與化療和/或放療的獲得性抵抗有關(guān)[4]。影響治療和預(yù)后的一個重要因素為宮頸癌干細(xì)胞（Cervical cancer stem cells，CCSCs）的存在，它們位于腫瘤的局部區(qū)域，可啟動和維持腫瘤的生長[5]。因此，針對宮頸癌的治療可以通過阻止CCSCs 的克隆來降低或抑制腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)治療的抵抗性，從而預(yù)防遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)[6]。目前，尚未找到可明確判斷宮頸癌干細(xì)胞形態(tài)的特異性標(biāo)記物，從而限制了靶向腫瘤干細(xì)胞在宮頸癌治療方面的應(yīng)用。因此有效地分離干細(xì)胞是宮頸癌干細(xì)胞研究的前提和關(guān)鍵。有研究顯示，耐放療宮頸癌Siha 細(xì)胞系中CD44+CD24+細(xì)胞比重顯著升高[7]。故本研究旨在探討CD44+CD24+原代細(xì)胞是否表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞特性，為宮頸癌治療提供實(shí)驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物選擇體重20～22 g，4～6 周齡，SPF 級雄性Balb/c 裸小鼠24 只進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗[動物許可證號：SCXK(京)2007-0009]。實(shí)驗動物已獲得樂山市賽科動物護(hù)理中心的批準(zhǔn)。

1.2 組織標(biāo)本選取2017年1月—2018年2月武警四川省總隊醫(yī)院婦科接受手術(shù)治療的32例宮頸癌患者的組織標(biāo)本作為實(shí)驗組，另選取同期32 例子宮全切術(shù)患者的正常宮頸黏膜組織標(biāo)本作為空白組。

1.3 試劑及儀器DMEM-F12 腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)液（美國，GIBCO 公司）；FBS 胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗（美國，Thermo Fisher 公司）；抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合試劑盒（美國，Vector Laboratories公司）；大鼠抗小鼠初級抗體：CD24-FITC、CD24同型對照、CD44-PE、CD44 同型對照（美國，BD Pharmagen公司）。超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造，DICJ-2ND 型）；流式細(xì)胞儀（美國BD 公司，F(xiàn)ACS CantoⅡ型）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司，HERcell1501型）。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 分離培養(yǎng)宮頸癌原代細(xì)胞 無菌培養(yǎng)液洗凈宮頸癌組織標(biāo)本，無菌剪完全剪碎，加入胰蛋白酶消化30 min；4℃，3 000 r/min 離心 10 min，收集上清，PBS重懸，200 μm 細(xì)胞篩過濾，獲得單細(xì)胞懸液，置于DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基（成纖維細(xì)胞生長因子10 ng/mL+上皮生長因子20 ng/mL）中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換新鮮培養(yǎng)液。細(xì)胞融合率超過80% 時，可傳代1次。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分選處理 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶持續(xù)消化2～3 min，加入PBS，吹打細(xì)胞至完全吹散，置于5 mL 玻璃離心管，100 r/min，離心3 min，除去上清液后加入PBS 重懸，并對細(xì)胞計數(shù)。實(shí)驗組中選擇1×106個細(xì)胞分別與5 μL CD44-PE 抗體、5 μL CD24-FITC 抗體融合，40℃孵育30 min。對照組無需加入抗體。流式細(xì)胞儀完成檢測與分選，每組細(xì)胞確定平行對照共10個，每個樣品進(jìn)行3 次測定，結(jié)果取3 次平均值。根據(jù)分選結(jié)果進(jìn)行分組，未分選細(xì)胞為對照組，其余細(xì)胞分別為CD44+CD24+組、CD44-CD24-組。

1.4.3 免疫組織化學(xué)檢測 10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片。選擇抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。初級抗體抗小鼠 CD44(稀釋濃度 1∶30) 、抗小鼠 CD24(稀釋濃度1∶800)室溫孵化1 h或濕盒內(nèi)過夜。二氨基聯(lián)苯胺為染色劑，蘇木精逆染色，Universal Imaging Porporation的圖像分析儀計算灰度值。

1.4.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細(xì)胞增殖 收集細(xì)胞與10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基以1∶1 的比例混合，進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)。每組復(fù)設(shè)8 孔，每次間隔1 d，棄除上清，加入MTT 試劑，檢測細(xì)胞增殖情況，記錄450 nm處的光密度（OD）值。

1.4.5 裸小鼠異種移植瘤模型實(shí)驗 取雄性Balb/c 裸小鼠分為CD44+CD24+組、CD44-CD24-組和對照組，每組8只，取對數(shù)生長期濃度在1×104個/mL～1×107個/mL的CD44+CD24+、CD44-CD24-細(xì)胞各0.2 mL，在實(shí)驗組裸小鼠腋下進(jìn)行皮下接種，對照組不進(jìn)行接種處理。每周觀察1次，共觀察12周。

1.4.6 平板集落形成實(shí)驗 將3 組細(xì)胞稀釋后接種于培養(yǎng)皿，加入完全培養(yǎng)液，置于飽和濕度、5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14 d 后臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞菌落（＞50 個細(xì)胞團(tuán)）計數(shù)，計算細(xì)胞集落形成率（CFR）。

1.4.7 制備細(xì)胞端粒酶 EP 管分別收集1×1010個/mL 3 組細(xì)胞，離心，棄除上清液，加入裂解緩沖液，靜止30 min，對其上清液中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行半定量分析。

1.4.8 檢測端粒酶活性 通過端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）結(jié)合電泳、銀染法進(jìn)行檢測。利用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系（50 μL）：脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）混合物4 μL，模板鏈（Ts）引物2 μL，TaqDNA聚合酶 2 U，10×緩沖液5 μL，溶入雙氧水，30℃溫育10 min，加入反向（Cx）引物2 μL。反應(yīng)條件：95℃滅活30 s，1個循環(huán)；95℃變性5 s，50℃延伸30 s，72℃退火90 s，共40 個循環(huán)。10% 冰乙酸固定，40℃，0.2%硝酸銀染色；碳酸鈉0.28 mmol/L、甲醛0.02%的顯影液顯影。將對照組細(xì)胞端粒酶活性作為參照，其余兩組計算其端粒酶活性相對強(qiáng)度。端粒酶活性相對強(qiáng)度=待測標(biāo)本OD 值/未分選細(xì)胞OD 值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，方差齊的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果比較兩組宮頸癌原代細(xì)胞中CD44+和CD24+陽性細(xì)胞百分比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果/（，%）

表1 流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果/（，%）

組別實(shí)驗組空白組例數(shù)32 32 t P- -CD44+11.765±2.386 1.323±0.144 13.738＜0.001 CD24+42.153±7.637 6.982±0.824 14.413＜0.001 CD44+CD24+1.721±0.234 0.086±0.013 22.337＜0.001

2.2 各組CD44、CD24 表達(dá)分析免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，實(shí)驗組中CD44 和CD24 陽性表達(dá)率分別為87.50%、81.25%，與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 各組CD44、CD24表達(dá)情況比較/例（%）

圖1 CD44、CD24在兩組中的表達(dá)情況（×400）

2.3 各組細(xì)胞體外增殖情況比較MTT 法結(jié)果顯示，體外增殖 48、72、96 h，CD44+CD24+組細(xì)胞的增殖活性高于對照組和CD44-CD24-組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組細(xì)胞體外增殖MTT檢測結(jié)果（）

表3 各組細(xì)胞體外增殖MTT檢測結(jié)果（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與CD44-CD24-組比較，bP＜0.05。

OD450nm組別對照組CD44-CD24-組CD44+CD24+組F P 96 h 0.982±0.071 0.904±0.068a 1.105±0.084ab 265.225＜0.001 24 h 0.308±0.012 0.314±0.014 0.376±0.021ab 286.452＜0.001 48 h 0.516±0.042 0.488±0.034a 0.582±0.054ab 316.493＜0.001 72 h 0.856±0.066 0.715±0.062a 0.962±0.076ab 365.471＜0.001

2.4 各組細(xì)胞體內(nèi)成瘤率比較裸小鼠異種移植瘤模型實(shí)驗結(jié)果顯示，細(xì)胞數(shù)量為1×105個/mL～1×107個/mL時，CD44+CD24+組接種后開始出現(xiàn)新生瘤體，與對照組、CD44-CD24-組比較成瘤率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖2。

表4 各組裸小鼠接種成瘤率比較/例（%）

圖2 裸小鼠4周后皮下移植瘤形成情況

2.5 細(xì)胞集落形成實(shí)驗結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)14 d 后，CD44+CD24+組細(xì)胞集落形成率（0.423±0.131）%高于對照組（0.258±0.084）%；CD44-CD24-組細(xì)胞集落形成率（0.073±0.040）%低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,見圖3。

圖3 3組細(xì)胞細(xì)胞集落結(jié)果圖

2.6 各組細(xì)胞端粒酶活性結(jié)果比較CD44+CD24+組細(xì)胞端粒酶相對表達(dá)強(qiáng)度（4.79±0.78）高于對照組細(xì)胞（1.02±0.28），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD44-CD24-組細(xì)胞端粒酶相對表達(dá)強(qiáng)度（0.46±0.09）低于對照組細(xì)胞（1.02±0.28），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細(xì)胞端粒酶相對表達(dá)量

3 討論

多年來，人類乳腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等多項研究均證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的致癌作用。腫瘤干細(xì)胞起源同正常干細(xì)胞，受多因素、多階段影響，且都處于未分化狀態(tài)，能自我更新，還可無限增殖[10]。兩者差異在于正常干細(xì)胞的增殖、凋亡始終保持平衡，主要是受其自我更新反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的影響[11]，而腫瘤干細(xì)胞會出現(xiàn)多基因突變，細(xì)胞增殖會喪失控制，最終生成腫瘤[12]。腫瘤干細(xì)胞致瘤性強(qiáng)，耐藥性高，故化療失敗率高[13]。目前，腫瘤細(xì)胞種群分類與表面標(biāo)記表達(dá)相結(jié)合的方式已被用于鑒定組織中是否存在干細(xì)胞[14]。2007年，Heidt等[15]首次分離出一種胰腺癌細(xì)胞亞型，這些細(xì)胞具有自我更新能力，同時存在高致瘤性、多向分化特性，且CD44、CD24表達(dá)較高，從而為癌癥的研究提供了有價值的工具。CD44、CD24 為細(xì)胞黏附分子，在間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)豐富，與腫瘤細(xì)胞遷徙、分化、增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。有研究顯示，宮頸儲備細(xì)胞是宮頸癌細(xì)胞的起源，屬于干細(xì)胞范疇，作為一種多潛能細(xì)胞，具有類似于腫瘤干細(xì)胞的雙向分化潛能[17]，其具備的特性如增生、多潛能分化是引起宮頸上皮復(fù)雜病理變化的重要基礎(chǔ)，而CD44、CD24 在各型宮頸儲備細(xì)胞中也均呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性表達(dá)[18-19]。

本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，宮頸癌原代細(xì)胞中CD44+CD24+細(xì)胞少量表達(dá)，正常宮頸原代培養(yǎng)細(xì)胞中CD44+CD24+細(xì)胞含量極低，說明CD44、CD24 可作為宮頸癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物，進(jìn)一步免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，其陽性表達(dá)率高于空白組，說明CD44+CD24+宮頸細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)分子變化，導(dǎo)致癌變的發(fā)生。腫瘤干細(xì)胞鑒定最重要的是判斷其是否具備干細(xì)胞自我更新能力、無限再生能力。本研究通過體外MTT 法、細(xì)胞集落形成實(shí)驗以及體內(nèi)裸小鼠移植瘤實(shí)驗證實(shí)CD44+CD24+組細(xì)胞體外增殖活性高于CD44-CD24-組細(xì)胞。端粒酶是核糖核蛋白復(fù)合物，存在特殊逆轉(zhuǎn)錄活性，其結(jié)構(gòu)包括端粒酶RNA、催化亞單位—端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），可通過維持端粒的長度，使細(xì)胞保持體外長期傳代、自我更新的生物學(xué)特性，其陽性表達(dá)關(guān)聯(lián)著細(xì)胞無限增殖。本研究中，CD44+CD24+組細(xì)胞端粒酶相對表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞集落形成率高于對照組，CD44+CD24+細(xì)胞端粒酶高水平表達(dá)也進(jìn)一步說明宮頸癌CD44+CD24+細(xì)胞具有明顯的腫瘤干細(xì)胞特性，提示高代培養(yǎng)的CD44+CD24+細(xì)胞具有較高的自我更新、無限增殖潛力。

綜上所述，CD44和CD24有望成為CCSCs表面標(biāo)記分子，為靶向?qū)m頸癌腫瘤干細(xì)胞治療提供一定的實(shí)驗支持。