AMD3100聯(lián)合利妥昔單抗對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-2的影響及機(jī)制研究

馬志萍，曹燕珍，李新霞

（新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830054；2附屬腫瘤醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830011）

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是最常見(jiàn)的B 細(xì)胞淋巴瘤，據(jù)我國(guó)淋巴瘤診治協(xié)作組統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi) DLBCL 發(fā)病率高達(dá)40%～50%，高于國(guó)際的25%～30%[1]。不同分型的DLBCL 對(duì)治療反應(yīng)具有差異，同樣使用R-CHOP (美羅華+環(huán)磷酰胺+長(zhǎng)春新堿+阿霉素+潑尼松)治療方案，生發(fā)中心B 細(xì)胞型淋巴瘤（GCB）具有更長(zhǎng)的總生存期，而活化B 細(xì)胞型淋巴瘤（ABC）預(yù)后較差，其臨床總有效率不到40%[2-3]。說(shuō)明R-CHOP 并非是DLBCL 患者的最佳治療方案[4-6]。因此，發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)及抑制劑，并將其與R-CHOP 組合運(yùn)用治療，可能會(huì)顯著地提高患者的預(yù)后。有研究顯示，趨化因子受體4（CXCR4）在多種腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[7-9]。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的分泌、激活A(yù)kt/PI3K 等信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10]、發(fā)展[11]和轉(zhuǎn)移[12-13]，但在不同細(xì)胞系其調(diào)節(jié)機(jī)制有所不同。在DLBCL 活檢組織及細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)有CXCR4 蛋白和mRNA 的高表達(dá)[14]。但如何調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，激活A(yù)kt/PI3K信號(hào)通路促進(jìn)轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究旨在探討CXCR4抑制劑AMD3100與利妥昔單抗（Rituximab）對(duì)人DLBCL細(xì)胞株SU-DHL-2增殖、凋亡和侵襲能力的影響及可能的分子機(jī)制，為DLBCL的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑彌漫大B 細(xì)胞瘤細(xì)胞株SU-DHL-2（凱基生物，KG541），RPMI1640、FBS、雙抗（美國(guó)，Gibco公司）、Rituximab(美侖生物，MB2749）、AMD3100（美侖生物，MB5646），CCK-8 檢測(cè)試劑盒（碧云天，C0037）、凋亡試劑盒（凱基生物，KGA1026）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，P0010）、GAPDH 單克隆抗體（英國(guó)，Abcam 公司，Ab8245）、AKT 多克隆抗體（美國(guó)，CST 公司，4691T）、兔抗人p-AKT(pSer473)多克隆抗體（正能生物，310021）、兔抗人MMP-9 單克隆抗體（美國(guó)，CST 公司，13667T）、兔抗人MMP-2 多克隆抗體（武漢華美，CSB-PA003258）、兔抗人CXCR4多克隆抗體（武漢華美，CSB-PA006254）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 彌漫大B 細(xì)胞瘤細(xì)胞株SUDHL-2，采用RPMI1640 培養(yǎng)基，10%胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2，相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。將細(xì)胞分為對(duì)照組（未經(jīng)任何處理）、AMD3100 組（加入1 μmol/L AMD3100）、Rituximab 組（加入 10 μg/mL Rituximab）、聯(lián)合用藥組(加入1 μmol/L AMD3100，孵育1 h 后加入10 μg/mL Rituximab)。

1.2.2 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將 100 μL 濃度為 1×104個(gè)/mL SU-DHL-2 單細(xì)胞懸液加入96孔板，培養(yǎng)24 h，用AMD3100（1 μmol/L）預(yù)處理1 h，再加入Rituximab（10 μg/L）孵育24 h，向各孔分別加入 20 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h，使用Thermo酶標(biāo)儀，記錄450 nm波長(zhǎng)處各孔光密度(OD)值。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的光密度值，記錄并取各孔均值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將SU-DHL-2 單細(xì)胞懸液以3 × 105個(gè)/mL 密度接種至 6 孔板，每孔 1.5 mL。待處理完成，收集細(xì)胞，PBS 潤(rùn)洗 2 次，1 000 r/min，離心5 min；按照 Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit 操作說(shuō)明書(shū)加入500 μL Binding Buffer，重懸細(xì)胞；加入5 μL AnnexinV-APC、5 μL 7-AAD 混勻；室溫避光反應(yīng)5～15 min（同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，即正常細(xì)胞不加AnnexinV-APC 和7-AAD）；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)早、晚期細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 將SU-DHL-2 單細(xì)胞懸液以3×105個(gè)/mL細(xì)胞密度，接入6孔板，每孔1.5 mL，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；取200 μL 接種于Transwell 小室上室。向下室加入0.6 mL 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，再向各組下室分別加入AMD3100 和Rituximab，同時(shí)在Transwell 小室上室底部中央垂直加入100 μL，最終濃度為 300 μg/mL 的基質(zhì)膠（Matrigel），待成膠狀后分別加入200 μL 各組細(xì)胞懸液。37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell 小室，接入96 孔板，200 μL/每孔，即每種處理3個(gè)復(fù)孔，加入20 μL CCK-8，37℃培養(yǎng)4 h。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：將細(xì)胞分別以 64 000、32 000、16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、0個(gè)，每孔200 μL，接入96孔板中。

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 離心 SU-DHL-2 細(xì)胞株，加入120 μL裂解液，置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min，離心 5 min，各取 40 μg 變性蛋白質(zhì)樣品，采用二喹啉酰胺凝膠電泳（BCA）蛋白定量法進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。轉(zhuǎn)膜完成后，5%脫脂牛奶封閉2 h；所有抗體均以1∶1 000比例稀釋，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌5次，加入二抗，37℃孵育 2 h，PBST 洗滌 5 次；ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，BandScan分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用方差分析比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SU-DHL-2 細(xì)胞增殖作用比較CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMD3100組、Rituximab組細(xì)胞平均相對(duì)存活率分別為84.910%、80.151%，均顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組使用后的細(xì)胞存活率（59.431%）顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 各組對(duì)SU-DHL-2細(xì)胞增殖作用比較

2.2 各組SU-DHL-2 細(xì)胞凋亡結(jié)果比較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、AMD3100組、Rituximab組、聯(lián)合用藥組早期凋亡率分別為（5.140±0.367）%、（11.830±0.238）%、（13.540±0.575）%、（17.520±0.405）%。晚期凋亡率分別為（1.687.54±0.270）%、（3.440±0.278）%、（5.333±0.646）%、（12.810±0.783）%。AMD3100 組、Rituximab 組與對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組與AMD3100 組、Rituximab 組比較，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果圖

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)SU-DHL-2 細(xì)胞株遷移及侵襲能力的影響Transwell 小室遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組穿膜相對(duì)細(xì)胞數(shù)(100.000±0.526；100.000±0.432）均高于AMD3100組（85.253±0.530；86.943±0.592）、Rituximab組(79.743±0.531；81.073±0.433)、聯(lián)合用藥組（61.860±0.526；63.477±0.592）。AMD1300 組、Rituximab 組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；聯(lián)合用藥組與AMD1300 組、Rituximab 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞遷移侵襲結(jié)果圖

2.4 各組CXCR4 、AKT、pAKT、MMP-9、MMP-2 蛋白質(zhì)表達(dá)情況Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，AMD3100 組 、Rituximab 組 CXCR4、AKT、p-AKT、MMP-9、MMP-2的表達(dá)水平降低，聯(lián)合用藥后作用增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1、圖4。

表1 各組蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)結(jié)果比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與AMD3100組、Rituximab組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

蛋白質(zhì) 對(duì)照組AMD3100組Rituximab組 聯(lián)合用藥組CXCR4 AKT P-AKT MMP2 MMP9 100.000±5.367 100.000±15.570 100.000±11.170 100.000±11.700 100.000±9.300 74.170±8.401*100.200±11.320 64.870±8.604**63.22±13.57*68.480±14.300*75.290±3.655**95.910±11.420 63.940±4.789**63.490±5.079**70.820±2.587*55.490±8.476**#100.600±17.580 37.220±6.813**##36.72±7.667**#35.910±4.584*##

3 討論

利妥昔單抗（Rituximab）是人鼠嵌合型單克隆抗體，可特異地結(jié)合B淋巴細(xì)胞表面的CD20抗原，并引發(fā)一系列作用，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的凋亡。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Rituximab 聯(lián)合化療藥物可提高治療效果，但仍有30%患者在治療后短期內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)甚至在治療過(guò)程中無(wú)法有效控制病情等情況[2-3]。臨床上限制DLBCL療效的關(guān)鍵因素是原發(fā)性耐藥和化療過(guò)程中產(chǎn)生的獲得性耐藥。因此，進(jìn)一步探尋腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找反映腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)，為DLBCL 的治療提供新的治療靶點(diǎn)和思路已成為研究重點(diǎn)。有研究證實(shí)，轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞在趨化因子12（CXCL12）的作用下與基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合而獲得藥物抵抗性，CXCR4 基因作為CXCL12 的特異性唯一受體，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、趨向性侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中，故有效的阻斷CXCR4 與CXCL12 的結(jié)合，可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。

多項(xiàng)研究表明，CXCR4/CXCL12 軸通過(guò)激活A(yù)kt/PI3K 等信號(hào)通路，促進(jìn)伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌等細(xì)胞株的侵襲和轉(zhuǎn)移[14,16-17]。說(shuō)明阻斷CXCR4 與CXCL12 的結(jié)合可削弱腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力。AMD3100 作為CXCR4 抑制劑，可通過(guò)阻斷CXCR4/CXCL12 軸，發(fā)揮抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[18]，增加其對(duì)化療藥物的敏感性。Reinholdt 等[19]研究證實(shí)，CXCR4抑制劑AMD3100聯(lián)合Rituximab 在伯基特淋巴瘤中具有協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AMD3100、Rituximab 均能抑制 SU-DHL-2 細(xì)胞株的增殖，聯(lián)合用藥后其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲作 用 較 AMD1300、Rituximab 顯 著 增 加 。 說(shuō) 明AMD3100 聯(lián)合 Rituximab 對(duì) DLBCL 的 治 療具有協(xié)同效果。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，AMD3100、Rituximab 均可引 起 SU-DHL-2 細(xì)胞 株 內(nèi) CXCR4、AKT、p-AKT、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平的下降，聯(lián)合用藥后此作用增強(qiáng)。提示AMD3100 聯(lián)合Rituximab 可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)、抑制Akt/PI3K 等信號(hào)通路在DLBCL治療中發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，AMD3100聯(lián)合Rituximab對(duì)SH-DUL-2細(xì)胞株增殖、凋亡和侵襲具有調(diào)節(jié)作用，可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，有望為DLBCL 靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。