基于響應(yīng)面法的甘松揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化研究

楊祎辰 王二歡 王繼強(qiáng) 黨艷妮 唐茜琳 常暉 靳鵬博 馬存德

摘要 [目的]優(yōu)化甘松揮發(fā)油的提取工藝。[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)考察粒徑、料液比、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響，選定工藝參數(shù)和變化水平。采用Box-Benhnken響應(yīng)面法，以甘松揮發(fā)油含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立數(shù)學(xué)回歸模型。[結(jié)果]粒徑527 μm、料液比1∶10.2（g∶mL）、提取時(shí)間10.9 h為最佳提取工藝，揮發(fā)油含量為4.12%。[結(jié)論]在該條件下甘松揮發(fā)油提取穩(wěn)定、可靠。

關(guān)鍵詞 甘松;揮發(fā)油;響應(yīng)面法;提取工藝;優(yōu)化

中圖分類號(hào) R 284.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）08-0152-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.042

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Optimization of Extraction Process of Volatile Oil from Nardostachyos Radix et Rhizoma Based on Response Surface Methodology

YANG Yi-chen 1，2， WANG Er-huan 2， WANG Ji-qiang 2 et al

（1. Shaanxi Institute of International Trade & Commerce， Xianyang，Shaanxi 712046;2. Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Xi’an，Shaanxi 710075）

Abstract [Objective]To optimize the extraction process of volatile oil of Nardostachyos Radix et Rhizoma.[Method]The single factor experiment was used to investigate the influence of particle size， solid-liquid ratio， soaking time and extraction time on the volatile oil content of Nardostachyos Radix et Rhizoma， and the process parameters and change levels were selected. The Box-Benhnken response surface method was used to establish a mathematical regression model with the volatile oil content of Nardostachyos Radix et Rhizoma as the evaluation index. [Result] 527 μm particle size， 1∶10.2（g∶mL） solid-liquid ratio， and 10.9 h extraction time were the best extraction processes. Under these conditions， the volatile oil content was 4.12%. [Conclusion]Under this condition， the extraction of volatile oil from Nardostachyos Radix et Rhizoma was stable and reliable.

Key words Nardostachyos Radix et Rhizoma;Volatile oil;Response surface methodology;Extraction process;Optimization

甘松為敗醬科植物甘松（Nardostachys jatamansi DC.）的干燥根及根莖，其味辛、甘，性溫，外用祛濕消腫，內(nèi)服則有理氣止痛、開(kāi)郁醒脾之功效 [1]，其既是藏藥，又為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材。甘松藥用歷史悠久，首載于陳藏器的《本草拾遺》 [2]。李時(shí)珍 [3]稱其“產(chǎn)于川西松洲，其味甘”，故而得名甘松，又名甘松香、香松。松洲，即今松潘縣，為四川省阿壩藏族羌族自治州轄縣。揮發(fā)油是辛味中藥最主要的化學(xué)成分類型 [4]。甘松藥材中含有大量揮發(fā)性成分，其中以萜類化合物為主，既可藥用，亦作香料。甘松揮發(fā)油具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗心律失常和保護(hù)心肌細(xì)胞等作用 [5]。當(dāng)前對(duì)甘松揮發(fā)油的大量研究主要集中在揮發(fā)油成分的GC-MS分析及抗心律失常機(jī)制等，而關(guān)于甘松揮發(fā)油提取工藝的報(bào)道較少。帕依曼·亥米提等 [6]采用L9（3 4）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)甘松揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果表明最佳提取工藝條件為粗粉、加8倍量水、提取6 h。邱國(guó)旺等 [7]采用單因素試驗(yàn)對(duì)甘松揮發(fā)油提取的不同因素進(jìn)行研究，得出最佳工藝為投料量70%、加8倍量水、提取10 h。劉英慧 [8]采用L9（3 4）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選甘松揮發(fā)油得出的最佳提取工藝條件為加水量為10倍量、提取時(shí)間10 h、不浸泡?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，該研究以甘松藥材為原料，參照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版（四部）通則2024揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）提取其揮發(fā)油組分，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察提取工藝參數(shù)，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)甘松揮發(fā)油的最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為甘松藥材揮發(fā)油的提取提供數(shù)據(jù)支持，也為甘松資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

供試甘松藥材為步長(zhǎng)制藥甘肅藥源基地移栽品（種源來(lái)自四川紅原縣），經(jīng)陜西步長(zhǎng)制藥有限公司馬存德主任藥師鑒定為敗醬科植物甘松（Nardostachys jatamansi DC.）。

1.2 試劑與儀器

98-I-C數(shù)顯控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）;高速多功能粉碎機(jī)（上海市天祺盛世科技有限公司）;5、10、24、35、100目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（紹興市上虞華豐五金儀器有限公司）;娃哈哈飲用純凈水。

1.3 方法

1.3.1 甘松揮發(fā)油提取。

參照《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2024揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）測(cè)定甘松揮發(fā)油含量，并計(jì)算供試品的揮發(fā)油含量：

揮發(fā)油含量=甘松揮發(fā)油體積（mL）甘松藥材粉末量（g）×100%

1.3.2 工藝參數(shù)的篩選及優(yōu)化。

以揮發(fā)油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，分別考察粒徑、料液比（g∶mL）、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間4個(gè)因素（表1）對(duì)甘松揮發(fā)油提取工藝的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定考察因素及其變化水平，采用Design Expert 11軟件中的Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。以甘松揮發(fā)油含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立數(shù)學(xué)回歸模型，對(duì)現(xiàn)行的甘松揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)。

驗(yàn)證試驗(yàn)為確定該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，考慮到試驗(yàn)誤差和實(shí)際生產(chǎn)，在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按篩選的最佳提取工藝條件進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)篩選影響因素與水平

2.1.1 粒徑對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響。

分別稱定不同粒徑的甘松樣品26.25 g，控制揮發(fā)油提取條件為料液比1∶8（g∶mL）、浸泡時(shí)間0 h、提取時(shí)間6 h，考察粒徑對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，隨著粒徑的減小，甘松揮發(fā)油含量先急劇增加后緩慢下降，在粒徑為500 μm時(shí)，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.41%。

2.1.2 料液比對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響。

控制甘松揮發(fā)油提取條件為粒徑500 μm、浸泡時(shí)間0 h、提取時(shí)間6 h，同時(shí)固定加水量為210 mL，依次稱定相應(yīng)的甘松樣品適量，考察料液比對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，隨著料液比的降低，甘松揮發(fā)油含量大體呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，在料液比為1∶10時(shí)，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.23%。

2.1.3 浸泡時(shí)間對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響。

分別稱定過(guò)35目篩的甘松樣品21.00 g（粒徑500 μm），控制甘松揮發(fā)油提取條件為料液比1∶10、提取時(shí)間6 h，考察浸泡時(shí)間對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，甘松揮發(fā)油含量變化不大，在浸泡時(shí)間8 h時(shí)，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.44%，較浸泡時(shí)間0 h時(shí)提高1.60%。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響。

分別稱定過(guò)35目篩的甘松樣品21.00 g（粒徑500 μm），控制甘松揮發(fā)油提取條件為料液比1∶10、浸泡時(shí)間0 h，考察提取時(shí)間對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，甘松揮發(fā)油含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為10 h時(shí)，甘松揮發(fā)油含量最高，為4.41%。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝

基于甘松揮發(fā)油提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件與成本，篩選出粒徑（X1）、液料比（X2）和提取時(shí)間（X3）3個(gè)因素，采用Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案，共15組試驗(yàn)點(diǎn)，以綜合考慮甘松揮發(fā)油提取過(guò)程中的工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

采用Design Expert 11軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到揮發(fā)油含量（Y）與粒徑（X1）、料液比（X2）、提取時(shí)間（X3）之間的回歸方程Y=4.09+0.110 0X1+0.131 2X2+0.088 7X3-0.127 5X1X2+0.017 5X1X3+0.025 0X2X3-0.657 5X1 2-0.585 0X2 2-0.100 0X3 2。由方程可知，各因素對(duì)甘松揮發(fā)油含量的影響大小排序?yàn)閄2>X1>X3，即料液比>粒徑>提取時(shí)間。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型P=0.000 5<0.01，說(shuō)明該響應(yīng)面回歸模型極顯著，且模型失擬項(xiàng)P=0.235 1>0.05不顯著，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。模型中X1、X2、X3、X1X2、X1 2、X2 2項(xiàng)具有顯著性，表明各個(gè)自變量與因變量的線性關(guān)系較為明顯，對(duì)各因素繪制曲面圖和等高線圖，更能直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值結(jié)果，詳見(jiàn)圖4。

根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果和擬合的回歸方程，采用Design Expert 11軟件擬合后得到最優(yōu)揮發(fā)油提取工藝參數(shù)為粒徑527 μm、料液比為1∶10.2、提取時(shí)間10.9 h，在此條件下得到的揮發(fā)油含量為4.12%。

2.3 工藝驗(yàn)證

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，確定該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，同時(shí)考慮到試驗(yàn)的可操作性和便捷性，精密稱定甘松樣品26.25 g，重復(fù)3次。選擇揮發(fā)油提取工藝參數(shù)為粒徑500 μm、料液比1∶10、提取時(shí)間10 h。分別計(jì)算揮發(fā)油含量，平均值為3.95%（RSD=2.98%，n=3）。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，關(guān)于甘松藥材揮發(fā)油含量的測(cè)定及成分分析等方向的文獻(xiàn)報(bào)道不多，但對(duì)于揮發(fā)油含量的表達(dá)方式不統(tǒng)一。例如揮發(fā)油得率、揮發(fā)油收率 [9]、揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù) [10]、收油率及百分含量，其實(shí)際計(jì)算方式均與《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2024揮發(fā)油測(cè)定法中的揮發(fā)油含量相同?！吨袊?guó)藥典》明確指出，揮發(fā)油含量是揮發(fā)油量與供試藥材質(zhì)量的比值（mL∶g），甘松的揮發(fā)油含量不得少于2.0%（mL∶g），而該研究中測(cè)試的甘松樣品所含揮發(fā)油高于藥典標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到此次研究所用的甘松樣品為移栽品，故生長(zhǎng)年限高于野生品。揮發(fā)油為植物的次生代謝產(chǎn)物，隨著生長(zhǎng)年限的延長(zhǎng)，次生代謝產(chǎn)物含量的積累亦會(huì)增加。張宇霞等 [10]通過(guò)對(duì)不同批次的栽培、野生及市售甘松藥材的揮發(fā)油含量進(jìn)行對(duì)比測(cè)定，結(jié)果顯示各批次甘松揮發(fā)油的體積分?jǐn)?shù)為2.0%～5.2%，并且栽培品的揮發(fā)油含量明顯高于野生及市售品。余海清等 [11]通過(guò)對(duì)四川甘孜州不同產(chǎn)地甘松藥材的揮發(fā)油進(jìn)行含量測(cè)定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地甘松揮發(fā)油含量存在差異，并且與產(chǎn)地氣候環(huán)境、藥材生長(zhǎng)年限等因素有關(guān)。這均與該研究結(jié)果保持一致。

甘松是唯一被現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》收錄的敗醬科植物，多分布于青藏高原地區(qū)如甘南、阿壩及果洛等州。甘松藥材的市場(chǎng)供給完全來(lái)源于野生資源，隨著野生甘松的不斷采挖，導(dǎo)致藥材價(jià)格逐年上漲。雖然《中國(guó)藥典》中規(guī)定甘松的入藥部位為根及根莖，但市面上流通的甘松藥材往往以全草形式流通。當(dāng)?shù)卣嗤ㄟ^(guò)監(jiān)督手段，對(duì)甘松藥材的采挖及分布的草場(chǎng)進(jìn)行保護(hù)，以期實(shí)現(xiàn)甘松野生資源的可持續(xù)利用。但通過(guò)在甘南、阿壩和果洛等州的實(shí)地調(diào)查，甘松野生資源的恢復(fù)情況及資源現(xiàn)狀仍不容樂(lè)觀。

當(dāng)前，由于《中國(guó)藥典》中對(duì)甘松藥材的生長(zhǎng)年限沒(méi)有規(guī)定，亦未實(shí)行有效的甘松藥材規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致牧民采挖甘松完全按照市場(chǎng)行情進(jìn)行;另一方面，甘松作為芳香類藥材，常被作為揮發(fā)油的提取材料，而甘松藥材提取后的藥渣及廢棄物卻未能再進(jìn)行有效的利用，這無(wú)疑是對(duì)資源的極大破壞和浪費(fèi)。因此，該研究參照《中國(guó)藥典》提取甘松揮發(fā)油，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察提取工藝參數(shù)，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)甘松揮發(fā)油的最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，規(guī)范甘松揮發(fā)油提取的技術(shù)路線，以期為甘松藥材揮發(fā)油的提取提供數(shù)據(jù)支持，也為甘松資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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