擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥及其代謝物免疫檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

許梓紅，羅林，陳子鍵，王炳志，嚴(yán)義勇，孫遠(yuǎn)明，徐振林*

1(廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)2(深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳，518000)

擬除蟲(chóng)菊酯是從野菊花中提取的天然除蟲(chóng)菊酯的合成衍生物，由菊花酸酯以及其酸和醇的鹵化衍生物所組成[1]。擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑都含有酸基、中心酯鍵和醇基，其中酸基含有2個(gè)手性碳，因此擬除蟲(chóng)菊酯通常以立體異構(gòu)化合物(反式和順式)的形式存在[2]。擬除蟲(chóng)菊酯的毒性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，順式異構(gòu)體通常比反式異構(gòu)體毒性更大。根據(jù)在大鼠體內(nèi)的毒性信號(hào)，將擬除蟲(chóng)菊酯分為Ⅰ型和Ⅱ型，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1，主要差別是Ⅱ型菊酯類農(nóng)藥的醇基α碳上連著氰基。然而，某些擬除蟲(chóng)菊酯(如氰菊酯、氟菊酯)卻無(wú)法進(jìn)行這樣的分類，它們會(huì)同時(shí)產(chǎn)生這2種毒性信號(hào)[3-4]。擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥進(jìn)入人體后會(huì)快速代謝，發(fā)生酯鍵斷裂和氧化作用生成cis/trans-3-(2,2-二氯苯乙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙基-1-羧酸和3-苯氧基苯甲醇，3-苯氧基苯甲醇進(jìn)一步氧化成3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid, 3-PBA)[5]。

表1 擬除蟲(chóng)菊酯分類Table 1 Classification of pyrethroids

菊酯類農(nóng)藥是一種神經(jīng)毒劑，Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯具有不同的神經(jīng)毒性，其原理主要是對(duì)電壓門(mén)控鈉離子通道造成干擾。研究表明，擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥屬于內(nèi)分泌干擾物，可通過(guò)飲食攝入進(jìn)入人體[6]。具有生殖毒性、神經(jīng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性，甚至?xí)?dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]。3-PBA是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難以降解的雌激素類物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥生物礦化作用受阻，從而阻止了擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥完全轉(zhuǎn)化為無(wú)毒小分子物質(zhì)，危及人體健康[8]。因此，我國(guó)制定并頒布實(shí)施了一系列關(guān)于擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥安全使用和殘留限量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。GB 27779—2011《衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑安全使用準(zhǔn)則 擬除蟲(chóng)菊酯類》規(guī)定了衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑擬除蟲(chóng)菊酯的安全使用準(zhǔn)則，如規(guī)定溴氰菊酯、氯氰菊酯和氯菊酯等不宜在桑園、魚(yú)塘、河流、養(yǎng)蜂場(chǎng)等處及其周?chē)褂?，使用時(shí)要采取一般防護(hù)措施。我國(guó)最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定聯(lián)苯菊酯在根莖類和薯芋類蔬菜中的最大殘留限量為0.05 mg/kg，氟氰戊菊酯在梨、蘋(píng)果中的最大殘留限量為0.5 mg/kg等；歐盟標(biāo)準(zhǔn)EU441/2012規(guī)定聯(lián)苯菊酯在番茄中的最大殘留量為0.3 mg/kg，馬鈴薯中氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯的最大殘留量分別為0.02和0.01 mg/kg等。

目前，檢測(cè)擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物的方法有很多。傳統(tǒng)檢測(cè)方法有氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10]，色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[11]等，但是這些儀器分析方法所需要的儀器昂貴，樣品前處理復(fù)雜，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)來(lái)進(jìn)行農(nóng)殘檢測(cè)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分析方法的不足，實(shí)現(xiàn)低成本、高通量的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，近些年來(lái)免疫學(xué)分析方法迅猛發(fā)展，為擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物的檢測(cè)帶來(lái)了福音。本文將在解析當(dāng)前擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥半抗原和抗體制備方法的基礎(chǔ)上，就免疫檢測(cè)新方法在擬除蟲(chóng)菊酯檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并簡(jiǎn)要介紹該方法在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 半抗原的設(shè)計(jì)合成

1.1 常規(guī)設(shè)計(jì)思路

擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000，單獨(dú)存在時(shí)不具有免疫原性，需要與載體蛋白結(jié)合后才可以作為免疫原。由于大部分?jǐn)M除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥沒(méi)有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的活性基團(tuán)，需要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或合成其結(jié)構(gòu)類似物，再與蛋白質(zhì)偶聯(lián)形成人工抗原。從結(jié)構(gòu)上看擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥分子有3個(gè)連接載體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，分別為環(huán)丙烷基衍生物結(jié)合位點(diǎn)，—H(Ⅰ型)或—CN(Ⅱ型)和3-苯氧苯基衍生物結(jié)合位點(diǎn)。按照結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成半抗原有以下4種途徑[12]，如圖1-A所示。(1)在菊酯的環(huán)丙烷部位接上連接臂：其中采用氧化擬除蟲(chóng)菊酯環(huán)丙烷部位的烯基團(tuán)為羧酸的方法是制備半抗原較常用的方法。HUA等[13]用高錳酸鉀將聯(lián)苯菊酯分子中環(huán)丙烷上的雙鍵氧化為羧基；(2)將菊酯的R2位點(diǎn)上的氰基水解為羧酸作為連接位點(diǎn)，再連接含有—NH2的多碳化合物或氨基酸。張獻(xiàn)忠[14]合成溴氰菊酯并將R2位點(diǎn)上的氰基轉(zhuǎn)化為羧基合成了半抗原；(3)將連接臂設(shè)計(jì)在苯醚基末端，有3種方式：一是直接在苯氧苯基對(duì)位上衍生出3碳的羧酸；二是直接在苯氧苯基對(duì)位上衍生出一個(gè)—NH2；三是將苯氧基由某種羧酸取代，形成末端如苯氧乙酸的結(jié)構(gòu)；(4)將菊酯分解成菊酸或苯氧苯甲酸，將其作為半抗原。SONG等[15]將氰戊菊酯分解成2-(4-氯苯)-3-甲基丁酸，再和氨基己酸甲酯酸化合成半抗原；LU等[16]利用擬除蟲(chóng)菊酯代謝物苯氧苯甲酸合成半抗原3-(3-苯氧基-過(guò)氧化苯甲酰胺)-丙酸。關(guān)于擬除蟲(chóng)菊酯半抗原設(shè)計(jì)合成的報(bào)道如表2所示。

A-擬除蟲(chóng)菊酯合成半抗原四種常規(guī)途徑；B-氯菊酯代謝物半抗原分子建模圖1 擬除蟲(chóng)菊酯半抗原的設(shè)計(jì)合成Fig.1 The design and synthesis of pyrethroid haptens

表2 擬除蟲(chóng)菊酯半抗原的設(shè)計(jì)合成Table 2 Design and synthesis of pyrethroid haptens

1.2 計(jì)算機(jī)模擬輔助設(shè)計(jì)策略

上述半抗原設(shè)計(jì)方法是基于對(duì)抗體結(jié)合位點(diǎn)和抗原表位的分子結(jié)構(gòu)以及發(fā)揮作用的分子間結(jié)合力的理解而預(yù)測(cè)的，設(shè)計(jì)的結(jié)果需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試，其方法具有不確定性且耗時(shí)較長(zhǎng)。近年來(lái)，為了以更快速和更經(jīng)濟(jì)的方式獲得親和力和特異性高的抗體，也有研究者利用計(jì)算機(jī)輔助分子建模(computer aided molecular modeling, CAMM)預(yù)測(cè)半抗原的結(jié)構(gòu)，利用CAMM可以得到分子結(jié)構(gòu)和生物活性等信息，而這些分子結(jié)構(gòu)和生物活性是很難或不可能獲得的。在大多數(shù)研究中，通過(guò)設(shè)計(jì)了幾個(gè)候選半抗原，再利用CAMM對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，并計(jì)算價(jià)態(tài)和電荷。優(yōu)化后選擇結(jié)構(gòu)和電荷與目標(biāo)分析物最接近的半抗原作為免疫半抗原。一般情況下，通過(guò)此方法獲得的抗體對(duì)目標(biāo)分析物具有較高的敏感性和特異性，與其他類似物的交叉反應(yīng)性較低[24]。AHN等[25]設(shè)計(jì)合成了氯菊酯代謝物的4種不同類型的免疫半抗原，并借助化學(xué)辦公軟件研究合成半抗原的幾何結(jié)構(gòu)，選擇幾何形狀與分析物相匹配的半抗原進(jìn)行免疫。實(shí)驗(yàn)證明，將與目標(biāo)分析物的幾何結(jié)構(gòu)相似的半抗原進(jìn)行偶聯(lián)，免疫產(chǎn)生的抗體特異性更高，如圖1-B所示。HUANG等[26]通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬10種擬除蟲(chóng)菊酯的3D模型，發(fā)現(xiàn)特定三維構(gòu)象對(duì)分子印跡聚合物的識(shí)別能力有重要影響。因此，使用分子建模技術(shù)可以輔助半抗原設(shè)計(jì)，以開(kāi)發(fā)靈敏的免疫分析方法。

2 抗體制備與鑒定

擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥抗體的制備途徑主要有：應(yīng)用合成的人工抗原免疫大白兔產(chǎn)生多克隆抗體；利用人工抗原免疫小鼠，提取出其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出高特異性的單克隆抗體；結(jié)合噬菌體展示技術(shù)獲得的重組抗體；通過(guò)分子印跡技術(shù)獲得的仿生抗體。

2.1 傳統(tǒng)多/單克隆抗體

多克隆抗體制備簡(jiǎn)單、研制成本低，但由于免疫動(dòng)物的個(gè)體差異而特異性、親合性不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生批間差異。張獻(xiàn)忠[14]合成了溴氰菊酯的4種人工抗原，免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體，并建立了溴氰菊酯免疫親和色譜-高效液相色譜檢測(cè)方法。ZHANG等[17]制備了擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的4種多克隆抗體，并獲得了對(duì)Ⅰ和Ⅱ擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑均有同等高敏感性的最佳抗體包被組合，IC50為0.02 μg/mL，并用于水樣中擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的檢測(cè)。單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、性質(zhì)均一等優(yōu)點(diǎn)，易于大量生產(chǎn)。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有更強(qiáng)的識(shí)別特異性, 且這種特異性可人為篩選。HUA等[13]建立了一種靈敏的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法，用于檢測(cè)土壤化學(xué)屏障中的聯(lián)苯菊酯。其檢出限和IC50分別為0.004 mg/L和0.05 mg/L，與基于多克隆抗體的ELISA相比，敏感性提高了40倍。WANG等[19]利用單克隆抗體建立了一種靈敏、廣泛的選擇性直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法，用于擬除蟲(chóng)菊酯的檢測(cè)，通過(guò)對(duì)添加擬除蟲(chóng)菊酯的河流水樣進(jìn)行分析，回收率為74%～108%。

2.2 重組抗體

重組抗體是繼多克隆抗體和單克隆抗體之后的第3代抗體，小分子重組抗體一般包括Fab、Fv和scFv等，如圖2-A所示。與傳統(tǒng)抗體相比，重組抗體更穩(wěn)定、親和力更高，抗體制備周期短適合大規(guī)模生產(chǎn)，可實(shí)現(xiàn)分子水平的定向改造。吳元元等[18]利用基因工程技術(shù)制備了擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥可溶性單鏈可變區(qū)抗體，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，scFv抗體對(duì)氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯均有較高特異性，IC50分別為3.29、4.72、5.55 μg/mL。常繼辰[23]利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)和基因工程技術(shù)，制備了擬除蟲(chóng)菊酯單鏈抗體，結(jié)果表明所得單鏈抗體對(duì)氰戊菊酯具有一定的結(jié)合活性。

2.3 納米抗體

納米抗體是由駱駝科動(dòng)物缺失輕鏈的天然重鏈抗體的可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)組成的單域抗體，其可變區(qū)的相對(duì)分子質(zhì)量約為15 kDa，如圖2-B所示。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體具有相對(duì)分子質(zhì)量小、親和力高、穩(wěn)定性高、溶解性好、免疫原低、穿透力強(qiáng)、人源化簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)[27-28]。KIM等[20]以擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的主要代謝物3-PBA為目標(biāo)建立了基于VHHs的免疫分析。其構(gòu)建了噬菌體VHH文庫(kù)，通過(guò)與3-PBA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合篩選出7個(gè)VHH克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其IC50為1.4 ng/mL，檢測(cè)限為0.1 ng/mL，這表明利用免疫羊駝的序列和噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行抗體選擇特異性和敏感性高。ZHAO等[21]利用噬菌體文庫(kù)分離出一種廣譜特異性納米抗體用于檢測(cè)擬除蟲(chóng)菊酯，結(jié)果表明，氯氰菊酯、β-氯氰菊酯和氰戊酸酯的IC50分別為2.586、1.814、2.251 g/mL，該方法克服了用人工抗原免疫動(dòng)物制備抗體的局限性。WANG等[22]利用基因重組技術(shù)獲得納米抗體，基于此將其應(yīng)用于熒光偏振免疫分析技術(shù)，對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的代謝物3-PBA進(jìn)行了檢測(cè)。

A-傳統(tǒng)抗體、重組抗體和納米抗體結(jié)構(gòu)圖；B-VH與VHH序列比較圖圖2 納米抗體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of nanoantibody

2.4 仿生抗體

分子印跡技術(shù)是指合成的聚合物與目標(biāo)分子通過(guò)共價(jià)、非共價(jià)或半共價(jià)相互作用特異性結(jié)合的技術(shù)[29]，通過(guò)分子印跡技術(shù)得到的仿生抗體穩(wěn)定性好、特異性高。季芯羽等[30]制備了一種分子印跡熒光傳感器用于菊酯類農(nóng)藥代謝物間苯氧基苯甲醛的選擇性測(cè)定，其檢出限為0.267 μmol/L。HUANG等[19]合成了一種能識(shí)別10種擬除蟲(chóng)菊酯的雙假模板分子印跡聚合物，用于檢測(cè)雞肉樣品中的擬除蟲(chóng)菊酯，檢測(cè)限為0.3～6.0 pg/mL。CAI等[31]合成了擬除蟲(chóng)菊酯的分子印跡微球和熒光示蹤劑，用于測(cè)定羊肉和牛肉樣品中10種擬除蟲(chóng)菊酯，檢出限為6.4～17 ng/mL。

3 新型免疫學(xué)檢測(cè)方法

鑒于免疫學(xué)分析方法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分析方法的不足，因此許多擬除蟲(chóng)菊酯已經(jīng)建立了新型免疫學(xué)檢測(cè)方法，關(guān)于擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物的新型免疫檢測(cè)方法研究概況見(jiàn)表3。

表3 擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物的新型免疫學(xué)檢測(cè)方法Table 3 Novel immunological assays for pyrethroids and their metabolites

3.1 側(cè)流免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)的原理是以條狀纖維膜為固相，通過(guò)吸水墊的毛細(xì)管虹吸效應(yīng)，使樣品中待測(cè)抗原或抗體與層析膜上對(duì)應(yīng)的受體(抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)，形成的免疫復(fù)合物被截留在檢測(cè)帶，通過(guò)酶促反應(yīng)顯色或著色標(biāo)記物顯色，快速得到可視化結(jié)果。隨著研究的深入，除了常見(jiàn)的膠體金之外，研究者也開(kāi)發(fā)出新的靈敏度更高的標(biāo)記物。COSTA等[32]制備了一種抗體門(mén)控指標(biāo)釋放材料，將其固定在試紙條上，與智能手機(jī)讀數(shù)相結(jié)合，用于檢測(cè)擬除蟲(chóng)菊酯。所用的傳感材料結(jié)構(gòu)及其工作原理和試紙條的結(jié)構(gòu)(圖3)。這種傳感材料有許多優(yōu)勢(shì)，例如孔徑大小更適應(yīng)抗體，局部半抗原連接和聚乙二醇功能化，有助于微米大小的支架顆?？梢栽诓挥绊憚?dòng)力學(xué)或空白釋放的情況下使用。此外，使用聚乙二醇玻璃纖維膜、3D打印支架和智能手機(jī)，可以在2 min內(nèi)檢測(cè)到分析物，檢測(cè)限降低到1 ng/mL，此方法適合于其他的分析物和各種現(xiàn)場(chǎng)分析。

A-傳感材料結(jié)構(gòu)；B-試紙條組成結(jié)構(gòu)及檢測(cè)原理；C-側(cè)流免疫檢測(cè)結(jié)合手機(jī)讀數(shù)圖3 檢測(cè)擬除蟲(chóng)菊酯的側(cè)流免疫層析技術(shù)原理圖Fig.3 The schematic diagram of side-flow immunochromatography for the detection of pyrethroids

3.2 熒光免疫法

隨著世界各國(guó)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殘留限量標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格，迫切需要提高免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，因此科研工作者開(kāi)發(fā)出了更加靈敏的熒光免疫分析法。熒光免疫分析法在高特異性免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光技術(shù)的靈敏性，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好，易實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。其原理是當(dāng)制備好的熒光探針在發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)后，其熒光強(qiáng)度或與待測(cè)物質(zhì)的量相關(guān)，或因大小、距離的變化而發(fā)生改變[42](圖4)。目前在擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物的檢測(cè)中常用的熒光標(biāo)記物有熒光素、量子點(diǎn)、熒光納米顆粒等。

A-熒光素結(jié)構(gòu)式；B-量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)；C-熒光免疫法原理圖4 熒光免疫法Fig.4 Fluorescence immunoassay

熒光素[43]是常見(jiàn)的有機(jī)染料小分子，具有水溶性好、量子產(chǎn)率高、摩爾吸光系數(shù)高、無(wú)毒和成本低等優(yōu)點(diǎn)。FENG等[33]以羅丹明染料的激光誘導(dǎo)熒光作為標(biāo)記，采用微滴熒光猝滅競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析法對(duì)河水中的高氰戊菊酯進(jìn)行檢測(cè)。研究表明，高氰戊菊酯與羅丹明的結(jié)合物顯示出與純羅丹明類似的熒光，加入高氰戊菊酯抗體后，熒光減弱。再將含有高氰戊菊酯的樣品加入到微滴中時(shí)，會(huì)使熒光信號(hào)恢復(fù)，檢測(cè)下限為0.1 nmol/L。

量子點(diǎn)是1～10 nm的半導(dǎo)體晶體，通常由硅、硒化鎘、砷化銦或硫化鎘等材料組成，被光源照射后會(huì)產(chǎn)生特定的顏色[44]。劉景坤[34]制備出碲化鎘量子點(diǎn)，建立新型熒光標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)對(duì)蔬菜中的氰戊菊酯進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍為0.06～3.83 μg/mL。XIAO等[35]制備了具有自定義選擇性人工識(shí)別位點(diǎn)量子點(diǎn)的分子印跡二氧化硅層，建立了基于量子點(diǎn)的酶聯(lián)免疫吸附方法對(duì)魚(yú)中的氯氰菊酯進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其檢測(cè)下限為1.2 μg/kg。

為了提高擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物的檢測(cè)靈敏度，近年來(lái)也有研究通過(guò)采用新型材料如熒光納米顆粒分離和標(biāo)記抗體。納米材料的尺寸極小，其具有許多優(yōu)良的生物學(xué)和理化特性，如良好的生物相容性、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等，因此在生物領(lǐng)域內(nèi)被廣泛使用[45]。邱浩[36]將窄發(fā)射譜和高熒光量子產(chǎn)率的有機(jī)染料作為熒光團(tuán)，以納米SiO2顆粒為載體,在表面包覆印跡層，制備了一種熒光印跡復(fù)合材料用于檢測(cè)環(huán)境中的三氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯和氟胺氰菊酯。

3.3 免疫傳感器法

免疫傳感器技術(shù)是將免疫檢測(cè)技術(shù)和傳感技術(shù)相結(jié)合的一種新型生物傳感器技術(shù)，分為非標(biāo)記性免疫傳感器和標(biāo)記性免疫傳感器(圖5)。非標(biāo)記性免疫傳感器是利用待測(cè)的抗原或抗體能夠與固定在傳感器表面的識(shí)別元件發(fā)生特異性結(jié)合并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，再通過(guò)換能器將免疫反應(yīng)的變化轉(zhuǎn)化為光電信號(hào)，光電信號(hào)經(jīng)過(guò)記錄和處理后可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定量檢測(cè)。標(biāo)記性免疫傳感器則是采用酶、熒光試劑、同位素、金屬標(biāo)記物等本身可使免疫反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)待測(cè)物[46]。FRUHMANN等[37]開(kāi)發(fā)了安培免疫傳感器在海水不進(jìn)行任何預(yù)處理的情況下檢測(cè)溴氰菊酯，檢測(cè)下限為4.7 μg/L。WANG等[38]開(kāi)發(fā)了非標(biāo)簽阻抗法免疫傳感器對(duì)茶葉中氰戊酸酯進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)殼聚糖與玻碳電極上改性的戊二醛交聯(lián)，將氰戊菊酯抗體固定在電極上，用電子轉(zhuǎn)移電阻的增大來(lái)測(cè)定氰戊酸酯的含量, 檢出限為0.80 μg/L。

A-免疫傳感器工作原理；B-標(biāo)記型免疫傳感器檢測(cè)原理示意圖；C-非標(biāo)記型免疫傳感器；D-用于檢測(cè)3-PBA的納米電化學(xué)免疫傳感器的 制備工藝及傳感機(jī)理圖5 免疫傳感器原理圖Fig.5 The schematic diagram of immunosensor

將傳感器與納米材料聯(lián)合可以顯著提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。EL-MOGHAZY等[39]制備了一種新型的超靈敏納米體電化學(xué)免疫分析法，用于檢測(cè)尿液中擬除蟲(chóng)菊酯代謝物3-PBA。通過(guò)采用絲網(wǎng)印刷電極將游離的3-PBA與3-PBA-BSA偶聯(lián)物共價(jià)固定在檸檬酸修飾的尼龍納米纖維上，通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)與堿性磷酸酶包埋的納米體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人尿中3-PBA的檢測(cè)，檢出限為0.64 pg/mL。

近年來(lái)，在免疫傳感技術(shù)中，免疫芯片發(fā)展迅速。免疫芯片是將高特異性的免疫反應(yīng)與電子芯片技術(shù)相結(jié)合的一種高通量、高特異性的新型生物檢測(cè)技術(shù)[47]。免疫芯片技術(shù)主要采用微陣列點(diǎn)樣法將抗原抗體固定于玻片、硅膠板或多孔板上，使其高度集成，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)[48]。趙穎等[40]以載玻片為固相載體，將包被抗原共價(jià)結(jié)合固定在載體上，以膠體金為標(biāo)記材料，單克隆抗體為識(shí)別元件，用銀增強(qiáng)試劑放大信號(hào)，建立了甲氰菊酯等10種常見(jiàn)農(nóng)藥多殘留的免疫芯片檢測(cè)方法。蘭美靜[41]以硝酸纖維素膜為載體，抗原為捕獲探針，膠體金為標(biāo)記材料，制備了可同時(shí)檢測(cè)甲氰菊酯等9種常見(jiàn)農(nóng)藥的可視化免疫芯片。

4 應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

在擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥及其代謝物半抗原設(shè)計(jì)上，由于擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥大多有手性碳原子和多種光學(xué)異構(gòu)體，抗原決定簇較多，這對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯單抗的制備造成了一定的困難。因此在設(shè)計(jì)擬除蟲(chóng)菊酯半抗原結(jié)構(gòu)時(shí)，可結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助分子建模預(yù)測(cè)半抗原的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出具有光活性的半抗原。其次，擬除蟲(chóng)菊酯結(jié)構(gòu)相似性高，且部分?jǐn)M除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥具有多種光學(xué)異構(gòu)體，因此存在抗體間交叉率較高的問(wèn)題，為了提高抗體的特異性，在設(shè)計(jì)半抗原時(shí)應(yīng)突出其與其他擬除蟲(chóng)菊酯不同的結(jié)構(gòu)，解決交叉反應(yīng)的問(wèn)題。

抗體制備及篩選是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的核心，通過(guò)傳統(tǒng)方法免疫動(dòng)物獲得的單/多克隆抗體生產(chǎn)周期長(zhǎng)，篩選出的抗體適應(yīng)性較差，并不能適用于所有的免疫檢測(cè)技術(shù)。相對(duì)與傳統(tǒng)抗體，基因工程抗體制備周期短，操作簡(jiǎn)化，可以實(shí)現(xiàn)分子水平定向改造和抗體的多功能化；而仿生抗體重點(diǎn)解決了特異性和穩(wěn)定性問(wèn)題，在前處理應(yīng)用方面有應(yīng)用前景，是未來(lái)抗體制備的發(fā)展方向。因此可使用基因工程抗體、仿生抗體等代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體用于食品中的擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥及其代謝物的檢測(cè)。

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有快速、敏感性和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留方面的檢測(cè)得到了廣泛的應(yīng)用。隨著擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥越來(lái)越多地被應(yīng)用到農(nóng)業(yè)和家庭殺蟲(chóng)，應(yīng)用免疫學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行定性和半定量檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的控制和評(píng)估顯得尤為重要。進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度是利用免疫技術(shù)檢測(cè)擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥及其代謝物的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。隨著生物技術(shù)和納米材料的發(fā)展，可應(yīng)用新型的標(biāo)記材料如脂質(zhì)[49]、鐵氧化殼硅核磁性納米復(fù)合材料[50]等，實(shí)現(xiàn)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯及其代謝物進(jìn)行高通量檢測(cè)，也可結(jié)合多種標(biāo)記材料制成新型多功能材料來(lái)標(biāo)記目標(biāo)分子，以提高其檢測(cè)靈敏度。隨著免疫學(xué)技術(shù)發(fā)展不斷深入和完善，免疫學(xué)技術(shù)將在擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥及其代謝物的快速檢測(cè)方面得到更加廣泛的應(yīng)用，為人類的公共衛(wèi)生、營(yíng)養(yǎng)健康與疾病預(yù)防作出更大的貢獻(xiàn)。