超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂王幼蟲中煙酰胺單核苷酸的含量

趙彤，趙洪木，宋美潔，杜偉，吳黎明，范芳芳，薛曉鋒*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京，100093)2(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桑蠶蜜蜂研究所，云南 紅河哈尼族彝族自治州，661100) 3(安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京，100102)4(老滇凰生命科學(xué)院，江蘇 蘇州，215000)

蜂王幼蟲，也稱蜂王胎，是蜜蜂受精卵消化吸收工蜂分泌的新鮮蜂王漿后生長(zhǎng)而成的幼蟲，是蜂王漿加工的副產(chǎn)品，其凍干粉中含有約50%的粗蛋白和人體必須氨基酸，同時(shí)含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、生物活性酶等成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。研究證實(shí)，蜂王幼蟲具有抗衰老[2]、抗氧化[3]、提高免疫力[4]等功效，作為一種昆蟲食品，其在保健和功能食品行業(yè)具有重要的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。開展蜂王幼蟲功能組分挖掘及研究，對(duì)于促進(jìn)蜂王幼蟲新資源功能性產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用具有重要意義。

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成的重要前體物質(zhì)，其功能作用通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為NAD+實(shí)現(xiàn)[5-6]，主要包括參與多種疾病的預(yù)防，如Ⅱ型糖尿病、肥胖癥和心力衰竭等，是醫(yī)藥、功能性食品、化妝品等行業(yè)的珍貴原料[7-9]。2016年，代謝領(lǐng)域研究最有影響的刊物《Cell Metabolism》報(bào)道給實(shí)驗(yàn)鼠補(bǔ)充飼喂NMN可有效減輕小鼠與年齡相關(guān)的生理衰退，在沒(méi)有任何明顯毒性或有害影響的情況下，NMN可抑制與年齡相關(guān)的體重增加，可增強(qiáng)能量代謝，促進(jìn)體力活動(dòng)，改善胰島素敏感性和血脂水平，并改善眼功能和其他病理性疾病，證明了NMN在抗衰老方面的巨大潛力[9-10]。食品或功能產(chǎn)品中NMN的準(zhǔn)確測(cè)定方法是監(jiān)測(cè)產(chǎn)品中NMN含量和評(píng)價(jià)其功能的關(guān)鍵。已有研究表明，蜂王幼蟲富含核苷酸類物質(zhì)，而核苷酸類物質(zhì)是蜂王幼蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育的必要物質(zhì)之一[11]，但尚無(wú)關(guān)于蜂王幼蟲中NMN的研究報(bào)道。

因此，為了快速準(zhǔn)確測(cè)定蜂王幼蟲中NMN的含量，本文優(yōu)化了NMN的提取方法，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS)測(cè)定蜂王幼蟲中NMN的分析方法。應(yīng)用方法測(cè)定實(shí)際蜂王幼蟲樣品中NMN的含量，并研究其在不同貯存條件下的穩(wěn)定性，以期為蜂王幼蟲NMN含量分析和功能應(yīng)用，以及蜂王幼蟲產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 mL離心管、50 mL離心管，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；甲酸銨、甲酸，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；乙醇、甲醇：色譜純，美國(guó)MREDA公司；蜂王幼蟲LDH1和蜂王幼蟲LDH2、蜂王幼蟲凍干粉LDH-P1，老滇凰原料基地蜂場(chǎng)；其他幼蟲樣品S1～S9，浙江蜂場(chǎng)隨機(jī)取樣；煙酰胺單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度>95%，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6495 Agilent超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；高速離心機(jī)，湖南湘儀有限公司；渦旋混勻器，美國(guó)Scientific Industries公司；十萬(wàn)分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

精密稱取NMN標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為50、100、250、500和1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取新鮮蜂王幼蟲樣品5 g或凍干粉1 g于50 mL 離心管中，加入15 mL乙醇，渦旋混合2 min，后加入15 mL蒸餾水，渦旋混合5 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，蒸餾水定容。取出適量溶液，在8 000 r/min離心4 min，取上清液用蒸餾水稀釋至原質(zhì)量濃度的1/50，后經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流動(dòng)相A為5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.4%甲酸，體積分?jǐn)?shù))，流動(dòng)相B為甲醇；洗脫程序：0～3 min，0% B；3～4 min，0% B～90% B；4～8 min，90% B；8～10 min， 90% B～0% B；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：1 μL，流速：0.2 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：離子漏斗，電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；干燥氣溫度220 ℃；干燥氣流速15 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；噴嘴電壓500 V。

1.3.5 蜂王幼蟲中NMN的穩(wěn)定性研究

用1.3.2的提取方法、1.3.3的色譜條件和1.3.4的質(zhì)譜條件，測(cè)定-18、4 ℃和常溫條件下貯存0、1、2、3、4、5、6、7 d的蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

蜂王幼蟲中含有大量的蛋白質(zhì)，會(huì)影響NMN的提取和測(cè)定，因此，在提取NMN前，需先進(jìn)行蛋白質(zhì)的沉淀。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比了甲醇、乙醇和乙腈對(duì)蛋白質(zhì)沉淀能力，結(jié)果表明，乙醇可以有效沉淀蜂王幼蟲樣品中的蛋白質(zhì)。圖1展示了NMN的結(jié)構(gòu)式，可見其分子中包含2個(gè)裸露的—OH，親水性強(qiáng)，因此，選擇水為NMN的提取溶劑最合適。另外，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇和水的體積比為1∶1時(shí)，沉淀蛋白和提取效果最佳。實(shí)際樣品中NMN含量較高，在上機(jī)分析前需要將提取液進(jìn)一步稀釋(1/50～1/100)倍，此步驟可以明顯降低基質(zhì)影響，實(shí)現(xiàn)樣品中NMN的準(zhǔn)確測(cè)定。

圖1 NMN的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structural of NMN

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為優(yōu)化分離，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同體積分?jǐn)?shù)甲酸銨水溶液、甲酸-甲酸銨水溶液、不同體積比的甲醇、乙腈組成的流動(dòng)相以及4種色譜柱：Agilent Infinitylab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)(下文簡(jiǎn)稱HILIC-Z)、Halo AQ-C18(2.1 mm×50 mm, 2 μm)(下文簡(jiǎn)稱AQ-C18)、Agilent Infinitylab Poroshell 120 HILIC-OH5(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)(下文簡(jiǎn)稱HILIC-OH5)和Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm, 2.5 μm)(下文簡(jiǎn)稱HSS T3)的分離效果，根據(jù)NMN的分離度、響應(yīng)值和色譜峰型，選擇最佳的分離條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水相中加入甲酸和甲酸銨，不僅能提高NMN的響應(yīng)值，還能改善峰型，甲醇為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)比乙腈更高。HILIC-Z分離時(shí)，峰型較差，AQ-C18和HILIC-OH5對(duì)NMN的保留能力弱，且與基質(zhì)無(wú)法有效分離，HSS T3分離時(shí)，峰型尖銳對(duì)稱，無(wú)拖尾現(xiàn)象。因此，選擇含0.4%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液-甲醇溶液為流動(dòng)相，選擇HSS T3為分離色譜柱。圖2為NMN標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

圖2 NMN標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the NMN standard solution

NMN結(jié)構(gòu)上包含1個(gè)伯胺，容易生成[M+H]+離子，故選擇電噴霧正離子(ESI+)掃描方式，根據(jù)[M+H]+離子找到準(zhǔn)分子離子峰，進(jìn)一步對(duì)NMN的[M+H]+離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量、駐留時(shí)間及離子加速電壓，在MRM模式下選取響應(yīng)高，離子比穩(wěn)定的離子作為監(jiān)測(cè)離子對(duì)，優(yōu)化得到離子對(duì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，可以滿足NMN的準(zhǔn)確定性和定量。具體質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 NMN的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析條件Table 1 Retention time of NMN and its MS/MS acquisition settings

2.3 線性范圍、檢出限(limits of detection，LOD)、定量限(limits of quantitation，LOQ)

采用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行UHPLC-MS/MS方法學(xué)研究，以NMN的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，NMN標(biāo)準(zhǔn)品在50～1 000 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)信噪比確定LOD(S/N=3)以及LOQ(S/N=10)分別為11.2 μg/kg和37.4 μg/kg。

2.4 NMN提取液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取樣品，用1.3.2的方法制備提取液，按照1.3.3的色譜條件和1.3.4的質(zhì)譜條件，分別在0、3、6、18、24 h測(cè)定NMN的含量，并計(jì)算降解率，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 提取液的降解率 單位：%

結(jié)果表明，NMN提取液在24 h 后的降解率為4.87%，供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，樣品在提取完成后應(yīng)在24 h內(nèi)測(cè)定完成。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

由表3可知，在20、40和80 μg/g 3個(gè)添加水平下，NMN的添加回收率在109.9%～111.2%，RSD在0.87%～3.31%，說(shuō)明建立的方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足蜂王幼蟲中NMN的準(zhǔn)確測(cè)定。

表3 NMN加標(biāo)回收率Table 3 Standard recovery of NMN

2.6 實(shí)際樣品含量測(cè)定

按照上述優(yōu)化方法對(duì)蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉進(jìn)行檢測(cè)，圖3為樣品的總離子流圖(total ion chromatography，TIC)，圖4為樣品中NMN的MRM圖譜。蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量見表4。

圖3 樣品的TIC圖Fig.3 TIC chromatogram of sample

圖4 樣品中NMN的MRM圖譜Fig.4 MRM chromatogram of NMN in sample

表4 蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量Table 4 NMN content of queen bee larva and frozen dry powder of queen bee larva

由表4可知，蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中均含有NMN。其中，蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量更高，為78.0 μg/g，LDH1和LDH2樣品(試驗(yàn)蜂場(chǎng))中NMN含量分別為65.8 μg/g和62.5 μg/g，隨機(jī)蜂場(chǎng)采集的樣品S1～S9中NMN的含量為37.0～49.0 μg/g。蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉樣品中NMN的含量差異可能與蜂種、飼養(yǎng)方式、飼料類型以及幼蟲的采集和貯存條件相關(guān)。

與文獻(xiàn)報(bào)道的其他食品中NMN含量(0.1～3.3 μg/g)相比[13]，蜂王幼蟲中NMN的含量高出普通食品10～80倍，可以作為補(bǔ)充NMN的食品或功能產(chǎn)品資源。此外，NMN可能對(duì)蜂王幼蟲正常發(fā)育起重要作用[14]，其含量也可能影響蜂王健康和壽命，相關(guān)的研究還需要進(jìn)一步開展。

2.7 蜂王幼蟲NMN的穩(wěn)定性測(cè)定

為確定蜂王幼蟲中NMN在貯存期內(nèi)的降解情況，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 d，測(cè)定-18、4 ℃和常溫條件貯存的蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量，結(jié)果見表5。

表5 蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉在不同貯存條件下 NMN的降解率Table 5 NMN degradation rate of queen bee larva and frozen dry powder of queen bee larva with different storage condition

由表5可知，蜂王幼蟲在常溫保存時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)NMN出現(xiàn)快速降解，在第7天降解率達(dá)到96.4%；在4 ℃保存時(shí)，降解速率較常溫要慢，但在第7天仍可達(dá)到了88.5%；在-18 ℃保存時(shí)，蜂王幼蟲中的NMN在7 d內(nèi)未降解。蜂王幼蟲凍干粉在常溫、4和-18 ℃保存，7 d內(nèi)均未降解。說(shuō)明常溫和非冷凍條件(4 ℃)不利于蜂王幼蟲中NMN的保存，低溫或凍干可有效控制蜂王幼蟲中NMN的降解。蜂王幼蟲中NMN的降解可能與NMN腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的作用有關(guān)，在適當(dāng)條件下，將NMN轉(zhuǎn)化為NAD。凍干粉或-18 ℃低溫保存可以抑制蜂王幼蟲中的腺苷酰轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用，從而使其無(wú)法將NMN轉(zhuǎn)化為NAD。已有研究報(bào)道，由于NAD的分子質(zhì)量較大，無(wú)法通過(guò)口服攝取至細(xì)胞內(nèi)，而NMN可有效補(bǔ)償隨年齡增長(zhǎng)帶來(lái)的體內(nèi)NAD含量下降[9]。合理的保存和加工方法可保護(hù)蜂王幼蟲中NMN不被降解，對(duì)于保持蜂王幼蟲及其產(chǎn)品的品質(zhì)和功能活性具有重要意義。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜂王幼蟲NMN極易降解，所以在采集蜂王幼蟲樣品后，應(yīng)該將其及時(shí)冷凍或制成凍干粉以減少NMN的降解。作為重要的功能組分，NMN也可以作為蜂王幼蟲及其產(chǎn)品新鮮度和品質(zhì)評(píng)價(jià)的潛在指標(biāo)。

3 結(jié)論

論文通過(guò)優(yōu)化蜂王幼蟲中NMN的提取方法和分析條件，建立了UHPLC-MS/MS方法，并對(duì)蜂王幼蟲及其凍干粉樣品中NMN的含量進(jìn)行測(cè)定。方法快速簡(jiǎn)單，靈敏度高，在3個(gè)質(zhì)量濃度添加水平下，平均回收率為109.9%～111.2%，方法的RSD為0.87%～3.31%，可以實(shí)現(xiàn)蜂王幼蟲中NMN的準(zhǔn)確測(cè)定。應(yīng)用建立的方法，測(cè)定了蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉樣品中NMN的含量，并連續(xù)測(cè)定7 d不同貯存條件下NMN的含量變化。實(shí)際樣品中均檢出NMN，新鮮蜂王幼蟲的NMN含量為37.0～65.8 μg/g，蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量為78.0 μg/g。與文獻(xiàn)報(bào)道其他產(chǎn)品相比，蜂王幼蟲中NMN含量遠(yuǎn)高于其他常見的食品，可以作為重要的NMN補(bǔ)充食物來(lái)源。貯存試驗(yàn)結(jié)果顯示，在常溫或4 ℃條件下，蜂王幼蟲中的NMN快速降解，蜂王幼蟲樣品應(yīng)該在采集后-18 ℃冷凍貯存或加工為蜂王幼蟲凍干粉，以有效保護(hù)NMN不被降解。作為重要的功能成分，NMN也可作為蜂王幼蟲及其產(chǎn)品的功能性或新鮮度的潛在評(píng)價(jià)指標(biāo)，用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本研究建立的方法也為蜂王幼蟲產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用以及NMN在蜂王發(fā)育過(guò)程中的作用研究提供重要的技術(shù)支撐。