高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中三種姜黃素類化合物

周禹君，公丕學(xué)，戴琨，劉桂亮，薛霞，劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東省食品藥品安全檢測(cè)工程 技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南，250101)

姜黃素是從姜科植物姜黃等根莖中提取得到的一種二酮、二羥基，帶有共軛苯環(huán)和雙鍵結(jié)構(gòu)的天然黃色素。姜黃素(curcumin，CurⅠ)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin，CurⅡ)、雙去甲氧基姜黃素(bidemethoxycurcumin，CurⅢ)3種化合物，統(tǒng)稱姜黃素、姜黃色素或姜黃素類化合物，結(jié)構(gòu)見圖1[1]，其中Cur I的含量約為70%，Cur II約為10%～20%，而CurIII約為10%[2]。姜黃素安全性高，長(zhǎng)期以來作為一種常用的天然色素被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，在GB 2760—2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中也有姜黃和姜黃素作為著色劑在部分食品中添加及使用限量的要求。此外，近年來的研究表明姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗突變、提高免疫力等多種藥理作用和保健功能[3-6]，因而使其成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但姜黃素類化合物不穩(wěn)定，易受溫度、光線、濕度、pH等影響[7-8]。

圖1 三種姜黃素化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of three curcuminoids

基于姜黃素諸多藥用價(jià)值，姜黃素作為動(dòng)物飼料添加劑[9]已應(yīng)用于動(dòng)物飼料中，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第123號(hào)公告中明確了姜黃素可應(yīng)用于肉仔雞飼料中，并確定了最高添加限量為150 mg/kg，但對(duì)于蛋雞飼料沒有規(guī)定，應(yīng)視為不得添加。姜黃素添加于蛋雞飼料中，可提高蛋雞抗球蟲能力，增加雞蛋的抗氧化水平，還可降低新鮮和存儲(chǔ)雞蛋的脂質(zhì)氧化反應(yīng)，提高雞蛋的整體質(zhì)量。此外，姜黃素通過刺激免疫反應(yīng)和對(duì)球蟲病的控制方式增加蛋雞的整體健康。少量食用含姜黃素的雞蛋，對(duì)人體無任何不良反應(yīng)，但食用含量較高的雞蛋，也會(huì)出現(xiàn)如惡心、腹瀉、皮膚過敏癥狀，堿性燐酸酶、乳酸脫氫酶指數(shù)上升，對(duì)于易感個(gè)體來說，還會(huì)增加腎結(jié)石的發(fā)生。因此，綜合姜黃素作為飼料添加劑的應(yīng)用范圍和限量，以及姜黃素使用過量對(duì)人體存在危害風(fēng)險(xiǎn)等因素，檢測(cè)動(dòng)物源性食品雞蛋中姜黃素含量非常必要。

關(guān)于姜黃素類化合物檢測(cè)技術(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法較多，有分光光度法[10-11]、高效液相色譜法[12-14]、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]、薄層掃描法[17]、近紅外光譜法[18]、高效毛細(xì)管電泳法[19]、反相流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[20]、極譜催化波法[21]等，檢測(cè)基質(zhì)也較為廣泛，有中藥、保健品及食品等，其中食品包含預(yù)加工食品(如冷凍飲品、果凍、腌漬蔬菜等)、糧食制品、水果等。本文以動(dòng)物源性食品雞蛋為研究基質(zhì)，采用操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的測(cè)定方法，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中姜黃素類化合物含量的技術(shù)空白。

本文采用高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中3種姜黃素類化合物，通過考察姜黃素類化合物的穩(wěn)定性，優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件，選擇色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)等最佳色譜條件，實(shí)現(xiàn)雞蛋中3種姜黃素類化合物的精準(zhǔn)含量測(cè)定，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析，為相關(guān)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純)，德國(guó)Merck公司；乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck公司；甲酸(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；姜黃素(簡(jiǎn)稱CurⅠ，CAS號(hào)：458-37-7，純度≥98%)，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；去甲氧基姜黃素(簡(jiǎn)稱CurⅡ，CAS號(hào)：22608-11-3，純度≥98%)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；雙去甲氧基姜黃素(簡(jiǎn)稱CurⅢ，CAS號(hào)：33171-05-0，純度≥98%)，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；超純水由Milli-Q超純水機(jī)制得；實(shí)驗(yàn)用雞蛋購自超市。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(帶二極管陣列檢測(cè)器)，日本島津公司；Atlantis T3色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，美國(guó)Waters公司；3-18K型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；AB204-S型電子天平，德國(guó)Mettler Toledo公司；MS3型旋渦混合器，德國(guó)IKA公司；SB-800DTD超聲清洗儀，中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司；HGC-24型氮吹儀，中國(guó)恒奧科技有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

流動(dòng)相：取2 mL甲酸，用純水稀釋至1 L，混勻。

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取(精確至0.1 mg)3種姜黃色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混合后用甲醇溶解定容至10 mL，以CurⅠ、CurⅡ和CurⅢ分別計(jì)，溶液質(zhì)量濃度各自相當(dāng)于1 mg/mL。-18 ℃冰箱中避光保存，6個(gè)月內(nèi)含量穩(wěn)定。

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始流動(dòng)相配成0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-18 ℃避光保存1個(gè)月。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.50 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻后，超聲提取20 min，加5 mL乙腈飽和正己烷除脂2次，將試樣提取液全部轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用乙腈定容，混勻后轉(zhuǎn)入干凈離心管中，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜檢測(cè)。

1.3.3 分析條件

色譜柱：Atlantis T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水-乙腈(體積比1∶1)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫35 ℃；二極管陣列檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)425 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種姜黃素化合物穩(wěn)定性考察

2.1.1 pH對(duì)3種姜黃素的影響

為確定姜黃素類化合物溶液穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)將甲醇溶液分別調(diào)節(jié)pH至1、3、5、7、9、11后，稀釋至標(biāo)樣質(zhì)量濃度為5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過測(cè)定3種姜黃素的峰面積，來比較pH環(huán)境對(duì)3種姜黃素的影響，結(jié)果見圖2。

姜黃素類化合物結(jié)構(gòu)中存在鄰甲氧基苯酚結(jié)構(gòu)，由于鄰位效應(yīng)，酸性強(qiáng)于苯酚，化合物苯環(huán)上的—OH和—OCH3均為給電子基團(tuán)，使苯環(huán)電子密度增加，碳鏈上發(fā)生親電反應(yīng)。當(dāng)苯環(huán)上失去—OCH3后，給電子能力減弱，碳鏈的親電反應(yīng)活性減弱。當(dāng)溶液pH升高，姜黃素類化合物降解反應(yīng)成一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程，降解速率明顯加快，姜黃素類化合物的穩(wěn)定性為雙去甲氧基姜黃素≥去甲氧基姜黃素≥姜黃素，且溶液顏色也由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。因此，在酸性環(huán)境下，姜黃素類化合物更穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇pH=5的酸性環(huán)境保存姜黃素類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液。

圖2 不同pH環(huán)境對(duì)3種姜黃素的影響Fig.2 Effects of different pH environment on three curcuminoids

2.1.2 貯存條件的優(yōu)化

選擇最優(yōu)的貯存溫度和貯存時(shí)間對(duì)熱不穩(wěn)定的姜黃素類化合物至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)以質(zhì)量濃度為5 μg/mL 的3種姜黃素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為基礎(chǔ)，選擇較為穩(wěn)定的pH=5的酸性環(huán)境，比較了室溫(25 ℃)、冷藏(4 ℃)及冷凍(-18 ℃)3種溫度下目標(biāo)物的穩(wěn)定情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍條件下，3種姜黃素化合物均很穩(wěn)定。進(jìn)一步考察時(shí)間發(fā)現(xiàn)，在-18 ℃下，30 d內(nèi)3種姜黃素化合物的峰面積幾乎無變化，說明質(zhì)量濃度較低的姜黃素類化合物在-18 ℃下存放30 d是穩(wěn)定的，因此選擇該條件保存姜黃素類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見圖3。

a-冷凍-18 ℃；b-冷藏4 ℃；c-室溫25 ℃圖3 不同溫度條件下3種姜黃素保存30 d的曲線圖Fig.3 The graphs of the three curcuminoids stored at different temperatures for 30 days

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

姜黃素類化合物是由2個(gè)鄰甲氧基化的酚以及1個(gè)β-二酮組成，其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基基團(tuán)，因此，此類化合物微溶水，易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙二醇等有機(jī)溶劑和酸、堿性溶液等。本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇和乙腈2種常見溶劑，考察了不同溶劑比例下姜黃素類化合物的溶解度。由圖4可知，甲醇和乙腈對(duì)3種化合物的提取效果較好。因雞蛋含有大量蛋白質(zhì)、磷脂及脂肪等干擾成分，乙腈比甲醇沉淀效果更優(yōu)，溶液干擾物更少。此外，實(shí)驗(yàn)還嘗試在提取劑中加入適量甲酸，與甲醇、乙腈的提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果無明顯差別。為方便實(shí)驗(yàn)操作，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑。

圖4 不同提取溶劑對(duì)3種姜黃素提取效率的比較Fig.4 Comparison of extraction efficiency of three curcuminoids with different extraction solvents

2.2.2 濾膜的選擇

濾膜可能對(duì)姜黃素類化合物有吸附作用，因此實(shí)驗(yàn)中考察了不同濾膜對(duì)目標(biāo)物的影響。由于提取溶劑選用乙腈，測(cè)試選擇了混合纖維素膜(mixed cellulose membrane，MCM)、聚四氟乙烯膜(polytetrafluoroethylene membrane，PTFE)、尼龍膜(nylon membrane)和聚醚砜膜(polyethersulfone membrane，PES)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尼龍膜和PES對(duì)姜黃素類化合物有很大的吸附作用，嚴(yán)重影響目標(biāo)物含量的測(cè)定。PTFE對(duì)Cur III有吸附，影響定量結(jié)果，MCM對(duì)樣品處理溶液有很好的過濾效果，并且對(duì)3種目標(biāo)化合物均無吸附作用，因此本實(shí)驗(yàn)采用MCM作為過濾膜。

圖5 不同濾膜對(duì)3種姜黃素濾過效果比較Fig.5 Comparison of filtration effect of three curcuminoids with different filter membranes

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

色譜柱在液相色譜分離中起著至關(guān)重要的作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了YMC Carotenoid(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Symmetry Shield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)4種類型的色譜柱，對(duì)3種姜黃素類化合物的色譜保留行為進(jìn)行比較(圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YMC Carotenoid色譜柱針對(duì)同分異構(gòu)體分離效果好，在分離3種姜黃素化合物時(shí)，保留過強(qiáng)，分離效果差。在Waters Symmetry Shield RP18、Waters Xbridge C18和Waters Atlantis T3三種色譜柱上，3種姜黃素化合物均能有效分配和分離，其中Waters Symmetry Shield RP18和Waters Xbridge C18保留性能強(qiáng)，3種姜黃素類化合物峰形存在拖尾現(xiàn)象，影響定量結(jié)果。綜合考慮分離效果和定量準(zhǔn)確性，采用Atlantis T3色譜柱分離姜黃素類化合物，保留時(shí)間和分離度效果均為最好，且峰形對(duì)稱定量準(zhǔn)確，故最終選擇Waters Atlantis T3色譜柱作目標(biāo)物結(jié)果分析柱。

a-YMC Carotenoid色譜柱；b-Symmetry Shield RP18色譜柱；c-Atlantis T3色譜柱；d-Xbridge C18色譜柱圖6 不同色譜柱分離3種姜黃素的色譜圖Fig.6 Chromatography of separation of three curcuminoids from different columns

2.3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

姜黃素類化合物屬于多酚類化合物，分子兩端均有羥基，存在共軛苯環(huán)，會(huì)將氫氧鍵上的電子吸向氧一側(cè)，產(chǎn)生吸電子效應(yīng)，導(dǎo)致氫更容易解離，在色譜分析中會(huì)影響分離效果。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨、乙腈-水、乙腈-甲酸水等流動(dòng)相條件，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-乙酸銨條件，3種目標(biāo)物不能分離，而應(yīng)用乙腈-乙酸銨和乙腈-水流動(dòng)相條件時(shí)，3種姜黃素色譜峰較寬，拖尾嚴(yán)重，分離度低；當(dāng)加入甲酸后，目標(biāo)峰保留時(shí)間增加，分離度提高，改善峰型，且酸度的不同對(duì)分離度的影響程度也不同。其原因可能是酸性條件改變了姜黃素中的共軛體系，抑制姜黃素在溶劑中解離，使目標(biāo)峰峰型得到改善，柱效增加，樣品分離度也明顯提高。本文采用含0.2%甲酸水-乙腈溶液為流動(dòng)相，將3種姜黃素類化合物完全分離。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)采用紫外/二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(掃描范圍180～800 nm)，CurⅠ、CurⅡ和CurⅢ 3種化合物的最大吸收波長(zhǎng)在420 nm附近，由于3種物質(zhì)中姜黃素含量占比最大，因此選擇姜黃素的最大吸收波長(zhǎng)425 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)(圖7)。

圖7 三種姜黃素的光譜圖Fig.7 Spectral diagram of three curcuminoids

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍和檢出限

將質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL的3種姜黃素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入液相色譜儀，按1.5分析條件進(jìn)行分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比S/N確定定量限(表1)。

表1 三種姜黃素化合物線性關(guān)系與檢出限、定量限Table 1 Linear relationship, detection limit, and quantitative limit of three curcuminoids

2.4.2 加標(biāo)回收率和精密度

分別以低(1 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(500 mg/kg)3水平向空白樣品中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，考察方法的回收率與精密度，結(jié)果見表2。方法的平均回收率為85%～101%，精密度為0.34%～4.16%，表明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表2 添加回收率與精密度(n=6)Table 2 Recovery and RSD for the determination of neotame (n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)市售的雞蛋50批次進(jìn)行3種姜黃素類化合物的檢測(cè)分析，包括山雞蛋、草雞蛋、柴雞蛋等樣品，結(jié)果均未檢出。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了3種姜黃素類化合物的穩(wěn)定性，包括pH、貯存溫度、貯存時(shí)間等條件，優(yōu)化了前處理方法對(duì)3種姜黃素提取、凈化和濾過效果的影響，并優(yōu)化了色譜條件，建立了高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中3種姜黃素類化合物的分析方法。方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確，適用于批量雞蛋樣品中3種姜黃素類化合物的測(cè)定，可為相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。