整合素β3在肺腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用及應(yīng)用價值

穆佳倩，滕小艷，魏麗榮，仇 榮，桂鵬程，杜玉珍

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗科，上海 201306

肺癌患者的5年生存率為14% ～ 17%［1］，轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因［2］。肺腺癌是肺癌最常見的病理學(xué)類型，骨骼是肺腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位［3］，且以溶骨性骨轉(zhuǎn)移多見［4］。肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后，易伴有骨痛、神經(jīng)壓迫和高鈣血癥等骨相關(guān)事件，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［5］。

整合素（integrin，ITG）是主要的細(xì)胞黏附分子受體，幾乎參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的全過程［6］。整合素β3（integrin β3，ITGB3）是整合素家族的重要成員，參與腫瘤的黏附、血管生成［7-9］以及腫瘤親器官性轉(zhuǎn)移等過程［10-11］。然而，ITGB3是否與肺腺癌的骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，未見報道。本研究擬通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和臨床樣本分析ITGB3與肺腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；并構(gòu)建肺腺癌細(xì)胞ITGB3過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，探究ITGB3對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其在肺腺癌骨轉(zhuǎn)移中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、PC9，大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H460，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系SBC3、SBC5和正常的人胚肺細(xì)胞系MRC5均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖DMEM、RPMI-1640、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素（雙抗）、G418、不含EDTA胰酶、Exo-free FBS均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FITC 抗人CD61抗體、Human Integrin beta-3（ITGB3）ELISA試劑盒購自美國Elabscience公司；化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自美國Millipore公司；細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；兔抗人Integrin β3單克隆抗體、兔抗人MMP2單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；鼠抗人MMP9單克隆抗體、鼠抗人CD63單克隆抗體均購自美國Arigo公司；兔抗人TSG101單克隆抗體購自英國Abcam公司；exoRNeasy Serum/Plasma Midi試劑盒購自美國QIAGEN公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）均購自美國R&D systems公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒購自北京博樂通生物科技有限公司。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的肺癌數(shù)據(jù)集，分析ENSG00000259207（ITGB3）基因在肺癌中的表達(dá)及與肺腺癌分期的相關(guān)性，對每個表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2（x+0.001）變換；采用R 3.6.4軟件并使用秩和檢驗（Wilcoxon Rank Sum Tests）和符號秩檢驗（Wilcoxon Signed Rank Tests）進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3 患者血漿樣本的收集與外泌體ITGB3的檢測

收集2020年4月—2021年9月在上海市第六人民醫(yī)院就診的肺腺癌患者血漿，共49例。其中，肺腺癌無轉(zhuǎn)移患者15例、肺腺癌骨轉(zhuǎn)移患者10例、肺腺癌其他轉(zhuǎn)移患者9例，同時，收集15名健康體檢者血漿作為對照組。血漿的收集均使用含EDTA抗凝劑的紫色真空采集管，并在采血后1 h于4 ℃條件下、3000×g離心10 min，收集上層血漿，于 4 ℃、11000×g離心10 min。本項目經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院臨床倫理委員會批準(zhǔn)。

按照exoRNeasy Serum/Plasma Midi 試劑盒說明書要求提取患者血漿中的外泌體，采用透射電鏡檢測外泌體形態(tài)，采用粒徑分析（NTA）檢測外泌體大小，采用Western blot檢測外泌體標(biāo)志物TSG101和CD63的表達(dá)水平，采用Western blot和ELISA檢測血漿外泌體ITGB3蛋白水平。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞株的篩選

采用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549、SBC3和SBC5細(xì)胞系，采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H460和PC9細(xì)胞系，MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MRC5細(xì)胞系，培養(yǎng)基中均加入10%的胎牛血清和1%的青霉素和鏈霉素，細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，采用Western blot檢測各細(xì)胞ITGB3蛋白的表達(dá)水平，選取ITGB3低表達(dá)的肺癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定

在GenBank數(shù)據(jù)庫中查閱人源ITGB3全長的編碼區(qū)序列（ENST00000559488.5），采用PCR對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。將ITGB3目的片段與 pcDNA-3.1+/Neo質(zhì)粒進(jìn)行重組并酶切鑒定。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染實驗分為對照組（即空白細(xì)胞A549、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的A549-Mock＋）和實驗組（轉(zhuǎn)染ITGB3過表達(dá)質(zhì)粒的A549-ITGB3＋）。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，并使用G418（750 μg/mL）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用不含EDTA胰酶消化并離心，冷的PBS洗，加入FITC標(biāo)記的ITGB3抗體（用含3% BSA和0.1%Triton的PBS稀釋）4 ℃避光溫育 30 min，冷的PBS洗，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測ITGB3蛋白的表達(dá)水平；并用Western blot檢測ITGB3蛋白的表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞外泌體的分離鑒定

采用差速離心法，即細(xì)胞在含10% Exo-free FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，4 ℃條件下200×g離心10 min，上層液體2 000×g離心15 min，上層液體10 000×g離心30 min。繼續(xù)收集上清液轉(zhuǎn)移至外泌體超濾離心管中 （100 KD），3 000×g離心30 min，濃縮液經(jīng)0.22 μm孔徑濾器過濾，100 000×g離心70 min，沉淀物加PBS溶解分裝于-20 ℃保存用于后續(xù)分析。鑒定同血漿外泌體。

1.7 細(xì)胞周期

按照細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書要求對不同實驗分組細(xì)胞進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Modfit軟件進(jìn)行分析。

1.8 克隆形成

不同實驗分組細(xì)胞計數(shù)600個，分別接種于6孔板，培養(yǎng)2 ～ 3周，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞、結(jié)晶紫染色、風(fēng)干。倒置顯微鏡下觀察克隆集落并拍照；使用Image J軟件對各組細(xì)胞的克隆集落進(jìn)行計數(shù)。

1.9 Transwell小室實驗

Matrigel基質(zhì)膠按1∶8比例稀釋，取100 μL鋪入transwell上室，細(xì)胞計數(shù)1×105個接種至上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，棉簽擦去小室上層未侵襲的細(xì)胞，空氣中干燥。顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野觀察并拍照，使用Image J軟件對侵襲的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，以反映細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞遷移能力的檢測：transwell上室內(nèi)不鋪基質(zhì)膠，24 h終止實驗，其余操作同侵襲實驗。

1.10 Western blot檢測

收集細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組取30 μg總蛋白于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）中分離，恒壓100 V轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉，其中一抗均按1∶1 000的比例稀釋（ITGB3、MMP9、MMP2、TSG101、CD63和GAPDH），HRP標(biāo)記的二抗按1∶5 000比例稀釋，溫育PVDF膜，一抗4 ℃過夜，二抗室溫溫育1 h，TBST洗滌。使用化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影，使用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.11 外泌體ITGB3誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化實驗

取人的外周血10 mL按1∶1比例加PBS混勻，按照淋巴細(xì)胞分離液說明書提取人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），細(xì)胞計數(shù)鋪96孔板，2×105每孔。培養(yǎng)液中加30 ng/mL RANKL、15 ng/mL M-CSF，隔天換液，誘導(dǎo)7 d后加入肺腺癌細(xì)胞分泌ITGB3表達(dá)水平不同的外泌體（70 μg/mL）共培養(yǎng)。培養(yǎng)至14 d，按照TRAP染色說明書對細(xì)胞染色，顯微鏡下觀察多核破骨細(xì)胞分化情況。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ITGB3表達(dá)水平與肺癌臨床特征的相關(guān)性

分析TCGA數(shù)據(jù)庫下載的肺癌數(shù)據(jù)集可知，ITGB3在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織和肺鱗癌組織（P＜0.000 1，圖1A），在Ⅳ期肺腺癌組織中顯著升高（P＜0.000 1，圖1B）。以上結(jié)果表明，ITGB3高表達(dá)與肺腺癌進(jìn)展相關(guān)。

提取患者血漿外泌體，使用透射電鏡（圖1C）、NTA分析（圖1D）和Western blot（圖1E）對外泌體進(jìn)行形態(tài)大小分析和鑒定。對肺腺癌患者血漿外泌體中ITGB3的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)肺腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血漿外泌體ITGB3水平高于其他轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.000 1，圖1E、F），提示外泌體ITGB3與肺腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。

圖1 ITGB3的表達(dá)水平與肺癌臨床特征的相關(guān)性Fig.1 The correlation between the expression level of ITGB3 and the clinical features of lung cancer

2.2 ITGB3對肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2.2.1 ITGB3過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

檢測不同肺癌細(xì)胞株中ITGB3表達(dá)水平（圖2A），選取ITGB3表達(dá)相對較低的A549細(xì)胞構(gòu)建ITGB3過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549-ITGB3＋；驗證發(fā)現(xiàn)A549-ITGB3＋細(xì)胞中ITGB3的表達(dá)水平顯著高于對照組（1.033±0.114vs0.131±0.034，P＜0.05）（圖2B、C）。分離A549和A549-ITGB3+細(xì)胞分泌的外泌體，外泌體的鑒定同血漿外泌體（圖2D ～ F）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549-ITGB3+細(xì)胞分泌的外泌體中ITGB3高表達(dá)（圖2F）。

圖2 A549 ITGB3過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的的構(gòu)建Fig.2 Construction of A549 ITGB3 overexpression stable cell line

2.2.2 ITGB3對肺腺癌A549細(xì)胞周期、克隆形成的影響

流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，A549-ITGB3＋細(xì)胞周期與對照細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.556，圖3A）；克隆形成實驗顯示，A549-ITGB3＋細(xì)胞的克隆集落形成率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.930，圖3B），提示ITGB3過表達(dá)對A549細(xì)胞周期和克隆形成無明顯影響。

圖3 ITGB3過表達(dá)對A549細(xì)胞周期和克隆形成的影響Fig.3 The effect of ITGB3 overexpression on A549 cell cycle and clone formation

2.2.3 ITGB3對肺腺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549-ITGB3＋細(xì)胞的穿膜數(shù)目顯著高于對照組（侵襲：1366±96.50vs623.3±41.36，遷移：1201±107.2vs500±34.51，P＜0.001，圖4A、B）。檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP9、MMP2蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)A549-ITGB3＋細(xì)胞的中MMP9和MMP2水平顯著高于對照組（圖4C），提示ITGB3可能通過上調(diào)MMP2、MMP9表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖4 ITGB3過表達(dá)對A549細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Fig.4 The effect of ITGB3 overexpression on the invasion and migration ability of A549 cells

2.3 細(xì)胞外泌體ITGB3對破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用

為進(jìn)一步探討細(xì)胞外泌體ITGB3對破骨細(xì)胞分化的影響，將外泌體用于破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，采用TRAP染色觀察各組破骨細(xì)胞（TRAP染色陽性且核＞3個的細(xì)胞）的分化情況。結(jié)果顯示，A549-ITGB3+細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化效率顯著高于對照組（11.50±0.707vs5.5±0.707，P＜0.05，圖5），提示肺腺癌細(xì)胞高表達(dá)ITGB3的外泌體可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。

圖5 TRAP染色顯示肺腺癌細(xì)胞分泌的外泌體對破骨細(xì)胞分化的影響Fig.5 TRAP staining shows the effect of exosomes secreted by lung adenocarcinoma cells on the differentiation of osteoclasts.

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后差的重要因素，肺腺癌引起的溶骨性骨轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和生存期［12］。在臨床上，肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠影像學(xué)和骨穿刺活檢等，因靈敏度、特異度低以及輻射性等局限性，難以實現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的早發(fā)現(xiàn)、早診斷［13］。目前，肺腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚，因此，在臨床實踐中，缺乏可用于監(jiān)測骨轉(zhuǎn)移的有效分子標(biāo)志物。

ITGB3是整合素家族的重要成員，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已有較多的報道［14］。有研究報道，骨轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞高表達(dá)αvβ3，并可通過與骨基質(zhì)細(xì)胞因子骨橋蛋白、骨涎蛋白和纖連蛋白結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與骨基質(zhì)微環(huán)境的黏附［15］。將過表達(dá)ITGB3的小鼠乳腺癌細(xì)胞66cl4注射到同基因小鼠脛骨中可導(dǎo)致破骨細(xì)胞募集和骨吸收增加［16］。還有報道，認(rèn)為ITGB3在腫瘤的親骨性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，如在小鼠靜脈注射轉(zhuǎn)移模型中，將B16黑色素瘤細(xì)胞分別注入ITGB3靶向缺失及野生型小鼠的左心室，發(fā)現(xiàn)ITGB3靶向缺失的小鼠僅有4%發(fā)生溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨破壞，而有74%的野生型小鼠在14 d內(nèi)發(fā)生溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨破壞［17］。這些研究結(jié)果提示，ITGB3與腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能存在密切關(guān)系。

本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ITGB3與肺腺癌的進(jìn)展相關(guān)，收集肺腺癌患者血漿血漿外泌體，檢測ITGB3水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體ITGB3水平不僅與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而且與腫瘤患者的骨轉(zhuǎn)移呈高度正相關(guān)。進(jìn)而，采用肺腺癌A549細(xì)胞系構(gòu)建ITGB3過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株（A549-ITGB3+），收集A549、A549-ITGB3+細(xì)胞分泌的外泌體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITGB3過表達(dá)的A549-ITGB3+細(xì)胞的外泌體ITGB3也過表達(dá)。隨后，將腫瘤細(xì)胞分泌的ITGB3表達(dá)水平不同的外泌體用于破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)ITGB3高表達(dá)的外泌體對破骨細(xì)胞的促分化作用更明顯。以上結(jié)果提示，ITGB3與腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是診斷肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)志物。

本研究就ITGB3對肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用進(jìn)行了初步探討，同時，根據(jù)生物信息分析和患者血漿外泌體ITGB3的小樣本定量檢測，提示外泌體ITGB3可能是肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)志物，但以上推測只有體外干預(yù)實驗的證據(jù)和小樣本患者數(shù)據(jù)的支持，仍需要進(jìn)一步體內(nèi)干預(yù)實驗的證據(jù)以及大樣本臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。