泡菜中功能性乳酸菌的篩選及其應(yīng)用研究進(jìn)展

張雅雯，鐘源，郭愛玲*，唐丹萍

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，武漢 430070；2.柳州市柳南區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)服務(wù)中心，廣西 柳州 545027)

泡菜是新鮮蔬菜通過乳酸菌和酵母菌厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物，其中乳酸菌通過其代謝產(chǎn)物和低氧的環(huán)境成為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌，主要作用是抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵泡菜的品質(zhì)有著重要影響。中國(guó)泡菜歷史悠久，種類繁多，主要存在于四川、廣西、東北等地，由于其口味酸辣、口感爽脆，廣受人們的喜愛。但現(xiàn)階段中國(guó)泡菜大都生產(chǎn)于家庭式作坊，泡菜的品質(zhì)不易控制。因此，研究泡菜發(fā)酵過程中微生物生態(tài)變化、菌群的消長(zhǎng)規(guī)律，探討不同乳酸菌菌株的生理及功能特性，在食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域加強(qiáng)其應(yīng)用具有重要社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 乳酸菌的功能多樣性

乳酸菌種類繁多，是全球公認(rèn)的安全食品，同時(shí)還具有諸多功能性，可以提高食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保藏性。整理國(guó)內(nèi)外報(bào)道的部分乳酸菌的功能性，見表1。

表1 不同種類乳酸菌的功能性Table 1 The functionality of different types of lactic acid bacteria

2 泡菜中功能性乳酸菌菌種的篩選

2.1 產(chǎn)酸快、產(chǎn)酸量大的乳酸菌菌種的篩選

吳錦蘭等[6]以柳州傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍為原料，分離并篩選得到一株高產(chǎn)乳酸的乳酸菌菌株LB-1-23，測(cè)得其在合適的發(fā)酵條件下乳酸產(chǎn)量為12.74 g/L。篩選出高產(chǎn)酸乳酸菌可用于發(fā)酵劑的制備，縮短發(fā)酵周期，抑制雜菌生長(zhǎng)，保證產(chǎn)品品質(zhì)。

2.2 降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的乳酸菌菌種的篩選

亞硝酸鹽廣泛存在于肉類制品以及發(fā)酵蔬菜中，亞硝酸鹽會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害，如引起急性中毒，以及致癌、致畸[7]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者篩選出多株降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的乳酸菌。從我國(guó)特色發(fā)酵蔬菜中分離純化出植物乳桿菌JLSC2-6，結(jié)果表明在發(fā)酵10 h時(shí)，其亞硝酸鹽降解率達(dá)到87.52%，發(fā)酵30 h后，其降解率達(dá)99.06%[8]。從四川泡菜中分離得到短乳桿菌菌株AR123，在MRS(De Man, Rogosa, Sharpe)肉湯中測(cè)試其亞硝酸鹽降解率最高，達(dá)到99.85%[9]。

2.3 高耐受性的乳酸菌菌種的篩選

正常人體胃液的pH在1.5～4.5之間波動(dòng)變化，從成都地區(qū)的農(nóng)家自制泡菜中分離出高耐受性乳酸菌SC608。結(jié)果表明，pH 4.0時(shí)，SC608乳酸菌的相對(duì)存活率為80.06%，說明該菌株具有一定耐酸能力[10]。

正常腸道中膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%之間波動(dòng)變化，小腸中的膽鹽成分對(duì)乳酸菌有一定抑制能力，因此乳酸菌必須在此膽鹽濃度下保持較高的生物活性才有可能在腸道內(nèi)定殖成功。侯保朝等[10]以膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%作為參照，膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%時(shí)SC608乳酸菌的相對(duì)存活率為63.56%；膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.5%時(shí)，SC608的耐受膽鹽能力仍然顯著，相對(duì)存活率仍然可以達(dá)到59.14%，反映該菌株具有良好的耐膽鹽能力。

2.4 抗氧化功能的乳酸菌菌種的篩選

乳酸菌具有較好的抗氧化功能，研究表明一些乳酸菌具有較好的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)能力[11]。

從市售酸菜中分離篩選出一株對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的菌株b-2，其無細(xì)胞上清液(CFS)對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)91.3%，其無細(xì)胞提取物(CFE)對(duì)·OH的清除率為67.6%，其完整細(xì)胞(IC)對(duì)O2-·的清除率為62.8%[12]。從成都的自然發(fā)酵酸菜中篩選到3株發(fā)酵上清液的羥自由基和DPPH自由基的清除能力較好的菌株，且植物乳桿菌SC608的羥自由基清除能力最顯著。從彝族酸菜汁中篩選出4株還原力大于100 μmol/L，羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力較高的乳酸菌，分別為植物乳桿菌、副植物乳桿菌和副干酪乳桿菌，為乳酸菌益生菌劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[13]。

2.5 產(chǎn)共軛亞油酸的乳酸菌菌種的篩選

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是天然脂肪酸亞油酸與共軛雙鍵的位置和幾何共軛異構(gòu)體混合物的通用名稱，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗肥胖和抗氧化作用[14]，因此在藥物、食品和保健產(chǎn)品中具有廣泛的應(yīng)用潛力。商業(yè)CLA通常是使用葵花籽油作為原料通過堿異構(gòu)化生產(chǎn)的，含有CLA的異構(gòu)體副產(chǎn)物。而用于營(yíng)養(yǎng)保健和醫(yī)藥用途的CLA需要更安全的異構(gòu)體選擇性合成。因此，CLA的生物合成引起很多關(guān)注。

乳酸菌菌體中含有的亞油酸異構(gòu)酶(LAI)可將亞油酸(linoleic acid，LA)轉(zhuǎn)化成CLA，因此將LAI基因通過基因工程克隆至其他菌體中獲得CLA。優(yōu)化培養(yǎng)條件和誘變育種是當(dāng)前使用最多的篩選方式，研究者從發(fā)酵泡菜中分離和鑒定的植物乳桿菌菌株P(guān)C-3，可在有氧條件下將亞油酸轉(zhuǎn)化為CLA[15]。朱振元等[16]在添加0.04%亞油酸作為誘導(dǎo)劑的MRS培養(yǎng)基中研究7株乳酸菌，其中羅伊氏乳桿菌的CLA產(chǎn)生能力最高，水平為5.34 μg/mL。通過正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化：亞油酸0.06%，反應(yīng)溫度37 ℃，溫育時(shí)間30 h，pH 7.0，最大CLA量達(dá)到6.59 μg/mL，提高了23.4%。乳酸菌合成CLA仍處于研究階段，還沒有達(dá)到商業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)，希望著重開發(fā)相關(guān)功能性食品并向大眾普及相關(guān)知識(shí)。

2.6 高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌菌種的篩選

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、抗糖尿病和抗焦慮等生理效應(yīng)，近年來受到廣泛關(guān)注[17]。GABA可以通過化學(xué)合成，也可以通過微生物發(fā)酵獲得。在具有GABA產(chǎn)生能力的微生物中，乳酸菌(LAB)的安全性得到證明[18]。

GABA是由谷氨酸脫氫酶(GAD)將L-谷氨酸(Glu)α-脫羧產(chǎn)生，因此需提高GAD活性以獲得高產(chǎn)量GABA。可以通過在培養(yǎng)基中添加谷氨酸及其鈉鹽、優(yōu)化發(fā)酵條件及使用紫外或γ-射線誘導(dǎo)菌株突變以提高GABA的產(chǎn)量。Karimian E等通過從傳統(tǒng)泡菜中分離出具有高水平γ-氨基丁酸(GABA)的植物乳桿菌，可與乳酸乳球菌亞種單獨(dú)或共培養(yǎng)，在發(fā)酵的樣品中產(chǎn)生的GABA濃度為365.6 mg/dL。從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品中共分離出150株乳酸菌，其中有57株乳酸菌具有合成γ-氨基丁酸的能力，且篩選出一株產(chǎn)量較高的菌株短乳桿菌NL8，其產(chǎn)量高達(dá)(4.17±0.05) mg/mL[19]。現(xiàn)階段市面上有多款含有GABA的產(chǎn)品，但消費(fèi)量低，仍需要加大研發(fā)力度。

2.7 產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌種的篩選

細(xì)菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽類或蛋白類物質(zhì)，廣泛存在于乳酸菌代謝產(chǎn)物中。由于抗生素的濫用，導(dǎo)致很多有耐藥性的突變菌株，現(xiàn)階段需要尋找抗生素的替代品，細(xì)菌素被認(rèn)為是最佳的選擇。由于細(xì)菌素是蛋白類物質(zhì)，可以被腸胃中的蛋白酶水解，不會(huì)殘留在人體內(nèi)，因此不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，且具有較高的安全性。細(xì)菌素還可以抑制食物中腐敗菌的生長(zhǎng)，在食品保藏方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

從四川地區(qū)泡菜汁中篩選出一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌QH 18-4(菌種編號(hào)SICC 1.1438)為耐鹽魏斯氏菌，分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿假單胞桿菌有不同程度的抑制作用[20]。Chen X J等[21]從自制酸奶、市售散裝腌菜和袋裝榨菜中分離篩選到5株產(chǎn)細(xì)菌素能力強(qiáng)的乳酸菌菌株，對(duì)綠膿假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有很強(qiáng)的抑菌活性，并選出抑菌活性最強(qiáng)的菌株E2-2，初步鑒定其為戊糖乳桿菌。只有乳酸鏈球菌素Nisin被廣泛投入使用，主要原因是其他細(xì)菌素合成量低，后期可以通過誘變、基因工程等方法提高乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的能力。

2.8 產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌種的篩選

胞外多糖是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中生成的一種位于細(xì)胞壁外的黏液多糖或莢膜多糖，屬于微生物胞外多糖的一種，具有良好的免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗腫瘤、抗病毒、細(xì)胞保護(hù)及降低血清膽固醇等作用[22]。雖然用于化療的抗腫瘤藥物具有很強(qiáng)的活性，但其存在安全性和副作用問題，因此安全天然來源(如乳酸菌)的胞外多糖可作為合成抗腫瘤劑的良好替代品[23]。

從不同地區(qū)泡菜中分離篩選4株高產(chǎn)胞外多糖的菌株，其胞外多糖的產(chǎn)量在450～500 mg/L之間[24]。以自制泡菜為原料，分離得到2株植物乳桿菌和1株發(fā)酵乳桿菌，并對(duì)其胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，篩選出產(chǎn)胞外多糖含量最高的菌株，產(chǎn)量為351 mg/L[25]。乳酸菌產(chǎn)EPS的試驗(yàn)仍處于研究階段，如何獲得高產(chǎn)EPS乳酸菌是當(dāng)前面臨的最大難題。

3 功能乳酸菌菌種及菌劑的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 復(fù)合飼料

韓國(guó)腌制辣椒中分離出植物乳桿菌SK1305菌株，該菌株具有較高的耐酸性(pH 2.5)和膽汁耐受性(0.3%，W/V)。無細(xì)胞培養(yǎng)上清液(CFCS)對(duì)多種病原菌具有廣譜抗菌活性。分離株對(duì)MAC-T(牛乳腺上皮細(xì)胞)顯示出顯著的DPPH自由基清除活性(55.2%±0.6%)和超氧化物還原能力，因此，植物乳桿菌SK1305可作為增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)的飼料發(fā)酵的接種物[26]。市場(chǎng)上，農(nóng)富康品牌將乳酸菌與芽孢桿菌、酵母菌等制備成混合菌劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，穩(wěn)定改善水質(zhì)，預(yù)防動(dòng)物疾病；益加益品牌也將乳酸菌與多種有益微生物菌群混合制備成秸稈發(fā)酵劑，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高動(dòng)物繁殖能力與免疫力，并且經(jīng)過發(fā)酵后飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到明顯提高。

3.2 直投式發(fā)酵菌劑

康嬌等[27]利用從云南富源泡菜中分離得到的發(fā)酵乳桿菌FYa1制作直投式發(fā)酵劑，通過優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方，凍干菌粉的存活率為(68.53±0.09)%，F(xiàn)Ya1發(fā)酵劑的含菌量為(2.0±0.05)×108CFU/g。FYa1泡菜用直投式發(fā)酵劑具有優(yōu)秀的發(fā)酵性能，可抑制雜菌的生長(zhǎng)，在發(fā)酵過程中展現(xiàn)出良好的復(fù)活能力，為直投式發(fā)酵劑的研究提供了科學(xué)理論和應(yīng)用依據(jù)?，F(xiàn)在泡菜和酸奶的直投式發(fā)酵劑已經(jīng)大規(guī)模生產(chǎn)并使用，市面上比較有名的直投式發(fā)酵劑品牌有川秀、湯泉一品等。

3.3 生物抑菌劑

乳酸菌可作為生物抑菌劑在食品保鮮中應(yīng)用，即利用乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素及其他抑菌代謝產(chǎn)物抑制食品中常見致病菌和腐敗菌的繁殖。大量試驗(yàn)研究證明[28]，乳酸菌是控制食源性病原體天然而有效的菌株，可以抑制一些主要食源性致病菌如單增李斯特菌、沙門氏菌和大腸桿菌O157:H7等。

3.4 輔助醫(yī)療

近年來大量研究表明，乳酸菌制劑中所含有的活性益生菌可以刺激腸道內(nèi)益生菌的增殖，同時(shí)抑制腐敗菌和致病菌的繁殖。研究證明幼兒腸道菌群失調(diào)后，如果按要求服用富含益生菌的乳酸菌制劑，腸道內(nèi)的菌群平衡即可恢復(fù)，進(jìn)而起到治療腹瀉的作用。有試驗(yàn)證明攝入復(fù)合乳酸菌粉(嗜酸乳桿菌+乳雙歧桿菌+低聚木糖)的益生菌沖劑具有增強(qiáng)免疫力的功能作用[29]。Marion-Eliette K等[30]通過對(duì)300名腹瀉兒童進(jìn)行口服嗜酸乳桿菌制劑試驗(yàn)，結(jié)果表明，口服乳桿菌制劑后能減少腹瀉持續(xù)時(shí)間，大便次數(shù)、住院天數(shù)和病毒在糞便中的數(shù)量。乳酸菌咀嚼片、乳酸菌膠囊等即食性乳酸菌在國(guó)內(nèi)外都廣受歡迎。

4 展望

隨著全球消費(fèi)者健康意識(shí)的增強(qiáng)和市場(chǎng)的日趨成熟，“大健康”理念逐漸進(jìn)入人們生活，“大健康”產(chǎn)業(yè)即將成為新的全球經(jīng)濟(jì)焦點(diǎn)，益生菌對(duì)大健康產(chǎn)業(yè)非常重要，而乳酸菌作為益生菌，在維護(hù)人體健康方面具有重要作用。

泡菜中分離出來的乳酸菌種類多，探討一些乳酸菌的功能，其中抑菌、腸道調(diào)節(jié)等功能得到開發(fā)且應(yīng)用于市場(chǎng)，還有些功能仍處于研究階段，尚需有效篩選泡菜中功能性乳酸菌，利用現(xiàn)代生物技術(shù)探討乳酸菌的生理作用及其保健功能；有待進(jìn)一步利用生物信息學(xué)，建立微生物菌群體系，完善泡菜質(zhì)量控制的相關(guān)體系，實(shí)現(xiàn)功能性乳酸菌菌劑標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)，發(fā)揮其在食品、健康醫(yī)療、畜牧養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)種植領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，不斷創(chuàng)造社會(huì)價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益。

5 結(jié)語

綜上所述，泡菜中功能性乳酸菌種類多，乳酸菌產(chǎn)酸、降解亞硝酸鹽、耐酸耐膽鹽、高抗氧化性、產(chǎn)γ-氨基丁酸、產(chǎn)共軛亞油酸、產(chǎn)細(xì)菌素、產(chǎn)胞外多糖等逐步開發(fā)應(yīng)用，一方面利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探討功能成分，利用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)其功能作用；另一方面加強(qiáng)其在食品工業(yè)、生物與醫(yī)藥等方面的應(yīng)用，更好地滿足人們對(duì)健康的需求。