納豆及納豆芽孢桿菌研究進展

楊艷莉，吳雪玲，余知和*

(1.長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省荊州中學，湖北 荊州 434021)

納豆是以大豆為原料，煮熟后接種納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成。成品納豆表面呈金黃色，并覆有一層黏性物質(zhì)，口感軟爛，用筷子挑起后可出現(xiàn)長長的拉絲。與生大豆和蒸煮大豆相比，納豆含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸等，且易被人體吸收。此外，納豆具有多種生理功能，如溶解血栓、降低膽固醇、抗菌消炎、降血壓、延緩衰老、調(diào)節(jié)腸道、預防骨質(zhì)疏松癥等[1]。納豆芽孢桿菌是一類好氧型、有纖溶能力的桿狀細菌，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和較強的抗逆能力，應用前景廣泛[2]。本文簡述了納豆的起源和營養(yǎng)保健作用，以及納豆芽孢桿菌的菌株篩選、多樣性及應用等，為納豆生產(chǎn)優(yōu)化、納豆芽孢桿菌菌株改良、推進納豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新思路。

1 納豆起源與制作

大豆作為良好的蛋白質(zhì)和脂肪酸來源，在中國有著悠久的食用歷史。發(fā)酵工藝使大豆的營養(yǎng)物質(zhì)得到了更好的利用，常見的發(fā)酵豆制品有豆豉、豆醬、醬油、腐乳等。豆豉可分為細菌型豆豉和真菌型豆豉，前者包括日本納豆、韓國清麴醬(Chungkukjang)[3]、泰國Thua-nao[4]、印度Kinema[5]等，真菌型豆豉則包括毛霉型、曲霉型、根霉型和脈孢菌型等，如印度尼西亞Tempe[6]。

納豆源于日本平安時代僧人的飯食，因當時的日本寺廟稱作“納所”，故僧人所食豆制品稱為“納豆”。有學者認為，納豆是中國的豆豉從云南傳入日本后演變而成。納豆的傳統(tǒng)制作方法是利用干稻草趁熱掩埋煮熟的大豆，借助稻草上的枯草芽孢桿菌，在40 ℃下發(fā)酵1～2 d即可。后工業(yè)化生產(chǎn)則是直接在煮熟大豆中接入納豆芽孢桿菌。研究表明，納豆的品質(zhì)受大豆品種、發(fā)酵溫度及時間、菌種及接種量等的影響[7-8]。

2 納豆營養(yǎng)與保健

納豆是粗蛋白和粗脂肪較為豐富的植物性食品，除含61.8%水分外，其主要成分為粗蛋白19.26%、粗脂肪8.17%、碳水化合物6.09%、粗纖維2.2%、灰分1.86%等，含有多種人體必需氨基酸及有益活性物質(zhì)，賦予納豆營養(yǎng)及保健作用。

2.1 納豆激酶預防心腦血管疾病

1987年，Sumi等從納豆中發(fā)現(xiàn)了一種能溶解血栓的纖溶酶——納豆激酶(nattokinase，NK)[9]，其溶解血栓的速度是尿激酶的19倍。該酶是納豆芽孢桿菌分泌表達的堿性絲氨酸蛋白酶，由275個氨基酸組成的單鏈多肽，具有纖維蛋白溶解活性[10]，其溶栓機理為直接有效地降解纖維蛋白；刺激血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生t-PA，增加纖溶酶的形成；抑制纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)活性，使t-PA增加，促使血栓溶解；將尿激酶原轉(zhuǎn)化為尿激酶，促進血栓溶解劑的產(chǎn)生[11]。其活性主要受3個方面的影響：物理方面包括溫度、干燥處理及包埋方式等，化學方面包括pH、金屬離子等，生物因素包括基因突變、菌種發(fā)酵等[12]。Lampe等[13]通過細菌回復突變、染色體畸變、急性毒性、臨床試驗等一系列毒理學評價，證明納豆激酶易被人體吸收,持續(xù)作用時間長,無不良副作用，且在腸道中穩(wěn)定性強，可直接口服。此外，納豆激酶可預防和治療阿爾茨海默癥和玻璃體視網(wǎng)膜疾病等[14]。

2.2 維生素K2防治骨質(zhì)疏松

維生素K2是一種脂溶性維生素，作為γ-羧化酶的輔助因子可維持骨骼強度，預防骨質(zhì)疏松。納豆在發(fā)酵過程中產(chǎn)生維生素K2，且98%為甲萘醌-7(MK-7)，是一種能預防骨質(zhì)疏松的保健食品。Wang等[15]通過檢測納豆芽孢桿菌生長過程中氧化還原電位的變化，發(fā)現(xiàn)充足的氧氣供應和良好的細胞膜狀態(tài)有利于維生素K2合成，提高氧化還原電位，增加維生素K2產(chǎn)量，并能獲得不含納豆激酶的純維生素K2。添加營養(yǎng)物質(zhì)和表面活性劑可促進維生素K2的產(chǎn)生，并且非離子表面活性劑的影響大于離子表面活性劑[16]。

2.3 黏液素和維生素B2減少脂肪堆積

黏液素和維生素B2在人體腸道中分別阻止脂肪吸收和促進脂肪消耗。納豆發(fā)酵產(chǎn)物γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一種特殊的陰離子聚酰胺，又稱納豆膠，由D-谷氨酸或L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基之間的酰胺鍵結(jié)合而成，是黏液素的組成物質(zhì)。γ-聚谷氨酸及其衍生物具有溶于水，對人體無毒，可生物降解等環(huán)境友好特點，在食品、醫(yī)療和廢水處理等方面廣泛應用。目前，γ-聚谷氨酸制備主要是通過非谷氨酸依賴型的枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌等發(fā)酵，合成途徑包括外消旋、聚合、調(diào)節(jié)和降解4個階段[17]。研究表明，納豆芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物納豆激酶抑制γ-PGA的產(chǎn)生。Wang等[18]為探討納豆激酶對γ-PGA產(chǎn)量的影響，在培養(yǎng)基中添加外源性活性納豆激酶和滅活納豆激酶，以添加蒸餾水作為對照，結(jié)果表明，活性納豆激酶和滅活納豆激酶均與γ-PGA合成呈正相關的顯著抑制，而且活性納豆激酶的抑制性更強，SDS-PAGE分析納豆激酶水解γ-PGA產(chǎn)物結(jié)果顯示，γ-PGA分子被納豆激酶切割成許多碎片，推斷納豆激酶可能是通過酶催化水解來降低γ-PGA產(chǎn)量，為如何提高γ-PGA產(chǎn)率提供了方向。此外，經(jīng)常食用納豆能調(diào)節(jié)人體內(nèi)巨噬細胞凋亡抑制因子(AIM)含量，溶解體內(nèi)脂肪細胞，減少脂肪堆積。

2.4 其他

除上述營養(yǎng)與保健作用外，納豆中的許多物質(zhì)會對人體產(chǎn)生積極影響，如酵素可清除體內(nèi)部分膽固醇，分解酸化型脂質(zhì)，降低血壓；多胺、染料木素、胰蛋白酶抑制劑有抗癌作用；卵磷脂、維生素、亞油酸等不飽和脂肪酸可減少過氧化物產(chǎn)生，改善皮膚，延緩衰老；蛋白酶和纖維酶能促進蛋白質(zhì)降解，提高蛋白質(zhì)消化率；大豆異黃酮又稱“植物雌激素”，可調(diào)節(jié)激素水平，治療更年期綜合癥。

3 納豆芽孢桿菌

3.1 生物學特性

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)俗稱納豆菌，是枯草芽孢桿菌的一個亞種[19]，大小為0.7～0.8 μm× 2.0～3.0 μm，具有鞭毛，能運動，好氧，革蘭氏陽性菌，能在5～55 ℃生長，最適生長溫度為37 ℃，最適pH為7.0，耐鹽，有一定耐高溫能力，生長規(guī)律符合一般細菌生長規(guī)律[20]。菌落呈圓形或不規(guī)則形，表面粗糙，邊緣不光滑，有褶皺，無光澤，呈灰白色或微黃色，中央顏色較深，有黏液。在不適環(huán)境下可產(chǎn)生內(nèi)生抗逆孢子，芽孢呈橢圓形或柱狀，中生或偏中生，孢囊膨大后不顯著[21]。Nishito等[22]對納豆芽孢桿菌BEST 195通過Illumina測序和基因組組裝，獲得染色體全長4091591 bp，G+C含量43.74%，蛋白質(zhì)編碼基因4375個，rRNA基因10個，tRNA基因93個，表明其與枯草桿菌家族第一個測序的實驗室標準菌株Marburg 168[23]的親緣關系密切。Kamada等[24]使用第三代高通量測序(PacBio RS)對納豆芽孢桿菌BEST 195重新測序，得到了4105380 bp的完整基因組，發(fā)現(xiàn)了B.subtilisMarburg 168的同源基因和轉(zhuǎn)座子編碼基因330個。

3.2 菌株多樣性

納豆芽孢桿菌菌株分離通常采用平板稀釋法，依據(jù)生理生化特性和分子性狀鑒定。生理生化特性包括革蘭氏染色、甲基紅實驗、過氧化氫酶實驗、淀粉水解和明膠液化等。分子鑒定借助細菌16S通用引物進行PCR擴增，通過16S rDNA基因序列同源性分析，確定親緣菌株。

傳統(tǒng)發(fā)酵納豆一般是借助于自然界的微生物，但不同地域及制作工藝的差別都會使微生物多樣性存在差異，從而對納豆質(zhì)量與風味產(chǎn)生不同的影響。傳統(tǒng)的可培養(yǎng)分離方法分析納豆芽孢桿菌費時費力，且在實驗室環(huán)境下，只有1%的微生物容易培養(yǎng)[25]。應用生理生化和分子生物學的方法包括Biolog法、脂肪酸甲酯(FAME)分析法、磷脂脂肪酸(PLFA)分析法，基于聚合酶鏈式反應(PCR)的變性/溫度梯度凝膠電泳技術(DGGE/TGGE)、單鏈構象多態(tài)性技術(SSCP)、擴增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)、末端限制片段長度多態(tài)性技術(T-RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)技術、高通量測序(high-throughput sequencing)等，以及基于分子雜交技術的熒光原位雜交技術、分子標記法等[26-27]，研究納豆芽孢桿菌多樣性及群落結(jié)構動態(tài)變化，可進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，改善納豆品質(zhì)，提高納豆產(chǎn)量。目前，已有關于中國豆豉微生物多樣性的研究，但多為真菌型豆豉[28-29]。

3.3 菌株篩選

納豆芽孢桿菌菌株通常是根據(jù)其生理生化特性如產(chǎn)蛋白酶、纖溶酶和維生素K2等來進行篩選，測定不同菌株在生長發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶活性或者其他代謝產(chǎn)物產(chǎn)量確定優(yōu)勢菌株[30]。為篩選符合目標條件的納豆芽孢桿菌，常采用誘變方式篩選突變菌株。誘變篩選因誘變劑不同分為物理誘變、化學誘變及復合誘變。

Mohanasrinivasan等[31]利用改良的Holmstorm法測定納豆激酶活性，然后對產(chǎn)酶菌株SFN01進行紫外誘變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變菌株表現(xiàn)出更高的凝塊溶解活性。Parks等[32]對產(chǎn)維生素K2菌株進行NTG誘變，得到的突變菌株(B.subtilisnattoVK161)產(chǎn)維生素K2最高水平為120 mg/L。該菌株基因組大小為4073396 bp，具有4332個編碼基因 (63.9%具有預測的功能)、23個rRNA基因、77個tRNA基因，G+C平均含量為43.33%。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma， ARTP)誘變技術是一項在微生物育種方面有諸多優(yōu)勢的新型誘變技術，可增強微生物的抑菌性、抗藥性和對有毒物質(zhì)的耐受性，尤其適合于產(chǎn)芽孢細菌的改良。孫博等[33]以納豆芽孢桿菌BSN 424為出發(fā)菌株，經(jīng)ARTP誘變篩選，得到一株富硒納豆芽孢桿菌BN-44，為益生菌作為富硒載體提供了支持。

單一誘變劑對微生物基因的作用點和作用效果單一。由于微生物基因修復機制復雜，在微生物育種實踐中常使用復合誘變來彌補單一誘變不足。常曉川等[34]以納豆芽孢桿菌BN-3為出發(fā)菌，將經(jīng)過紫外誘變的菌懸液涂布于硫酸二乙酯的BDP培養(yǎng)基平板上進行復合誘變，通過瓊脂塊法篩選得到突變菌株XC-80，并優(yōu)化其發(fā)酵條件使突變菌達到最高抑菌活性。

4 應用

4.1 微生態(tài)制劑

微生態(tài)制劑是指能促進正常微生物群生長繁殖和抑制致病菌生長繁殖的制劑，因其成本低、環(huán)境友好、效果顯著等，目前廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等領域。微生態(tài)制劑按物質(zhì)組成可分為益生菌、益生元和合生元，納豆芽孢桿菌屬于益生菌類。納豆芽孢桿菌制成的微生態(tài)制劑穩(wěn)定性強，能通過拮抗與生物奪氧，調(diào)整菌群，維持微生態(tài)平衡。于雷等[35]研究芽孢桿菌微生態(tài)制劑對雞產(chǎn)蛋性能及蛋品質(zhì)的影響時，添加飼喂納豆芽孢桿菌的雞產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)明顯高于其他芽孢桿菌。

4.2 天然防腐劑和抗菌劑

天然防腐劑是由生物體分泌或者體內(nèi)存在的具有抑菌作用的物質(zhì)，經(jīng)人工提取或者加工而成為食品防腐劑，安全穩(wěn)定。常用的防腐劑有山梨酸和尼泊金酯等，能有效干擾微生物酶類活性，但副作用高，對人體會造成一定損害。因此，開發(fā)天然防腐劑是亟待解決的問題。納豆芽孢桿菌的抗菌蛋白能對食品起到一定的防腐作用，同時提升食品的口感及品質(zhì)，被視為一類具有廣闊應用前景的天然食品防腐劑。

納豆芽孢桿菌能產(chǎn)生桿菌肽、多黏菌素、2,6-吡啶二羧酸和其他抗生素等次生代謝物，可抑制鼠傷寒沙門氏菌、痢疾菌、大腸桿菌等病原體作用，且具有熱、酸堿穩(wěn)定性，作用范圍廣。Osawa等[36]將葡萄球菌腸毒素A(SEA)污染的米飯與納豆混合，在37 ℃下孵育1 h，反向被動膠乳凝集試驗結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶可將SEA的蛋白分子裂解成小肽，降低抗SEA效價，且對其他類型的葡萄球菌腸毒素同樣有效。

4.3 功能性食品

作為益生菌，納豆芽孢桿菌被用于各種功能性食品開發(fā)。例如，利用納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵小米糠[37]、板栗[38]及銀杏種子[39]等，使小米糠可溶性膳食纖維含量從2.3%提高到13.2%，可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維比例從3.1%提高到19.9%，板栗及銀杏種子的總黃酮等含量增加，提高了板栗和銀杏種子的纖溶活性和抗氧化活性，降低了銀杏酸含量。Nie等[40]以豆?jié){和牛奶作為底物，利用納豆芽孢桿菌在35 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，添加其他添加劑后制成高納豆激酶活性的混合乳，作為血栓治療的食療途徑。除上述功能性食品外，可食性薄膜中的低聚果糖、冰淇淋功能性成分等都得益于納豆芽孢桿菌發(fā)酵。

4.4 飼料添加劑

納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌素等抗菌物質(zhì)，能提高動物的免疫力，改善腸道菌群，促進動物腸道消化，分解飼料中的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)，增進營養(yǎng)吸收，改善動物的外觀表象和健康狀態(tài)。另一方面，因其芽孢極強的抗逆性，在飼料加工過程中能耐受高溫、擠壓、無機鹽、酸化劑等，因此在動物的飼料與養(yǎng)殖中成為最常用的益生菌之一[41]。如在綿羊飼喂過程中，納豆芽孢桿菌能顯著提高綿羊的蛋白質(zhì)表觀消化率和日增重，降低血清尿素氮含量，復合添加枯草芽孢桿菌效果更佳[42]；通過改變瘤胃發(fā)酵方式，納豆芽孢桿菌能有效改善泌乳早期奶牛的泌乳性能，且對血液代謝產(chǎn)物無不良影響[43]。

4.5 其他

納豆芽孢桿菌還可用于酶活性增強劑、免疫增強劑和水質(zhì)改良劑等。納豆芽孢桿菌能分泌出各種促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的酶類，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、纖維素酶和脲酶等；在腸道中納豆芽孢桿菌能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，刺激機體產(chǎn)生免疫物質(zhì)，提高機體免疫力；與不同菌種相互作用分解水中的廢棄有機化合物、亞硝酸鹽、氨鹽、H2S等有害物質(zhì)，改善水體氧氣環(huán)境，提高溶氧量，給水生生物提供一個良好的生存環(huán)境并提供充足的養(yǎng)分[44]。

5 結(jié)語與展望

納豆作為一種天然保健食品，不僅營養(yǎng)全面，還能預防心腦血管疾病和骨質(zhì)疏松等常見病，因而受到眾多關注。納豆芽孢桿菌作為益生菌，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領域展現(xiàn)出了巨大潛力，其代謝產(chǎn)物充分滿足了人體的各種需要，通過多種誘變方式篩選得到的突變菌株也都具有穩(wěn)定的高產(chǎn)性能。目前納豆發(fā)酵常采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵，效率低且易污染，發(fā)酵菌株單一，產(chǎn)品的質(zhì)量取決于發(fā)酵過程中的微生物及發(fā)酵條件。因此，研究納豆微生物的多樣性，篩選優(yōu)勢菌株，優(yōu)化培養(yǎng)條件，從分子水平解析納豆芽孢桿菌菌株的基因組結(jié)構與功能，開發(fā)專屬發(fā)酵劑等將是未來有待探索的問題。