miR-122-5p對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制

郭占非　吳潔　楊學(xué)華　許振丹　范文強(qiáng)　高曉

[摘要]目的研究miR-122-5p對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。方法運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分別檢測(cè)正常關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、RA滑膜細(xì)胞中miR-122-5p以及盤狀結(jié)構(gòu)域受體激酶（DDR2）的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照（miR-NC）組（轉(zhuǎn)染mimic NC序列）、miR-122-5p寡核苷酸模擬物（miR-122-5p）組（轉(zhuǎn)染miR-122-5p模擬物mimics）、miR-122-5p特異性寡核苷酸抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-NC）組、miR-122-5p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-122-5p）組、miR-122-5p+pcDNA組（共轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics和空載體（pcDNA））、miR-122-5p+pcDNA-DDR2組（共轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics和DDR2過表達(dá)載體（pcDNA-DDR2）），用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至RA滑膜細(xì)胞。采用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中DDR2、P21和Survival的蛋白表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力。結(jié)果與正?；ぜ?xì)胞相比較，RA滑膜細(xì)胞中miR-122-5p的表達(dá)顯著降低，DDR2的表達(dá)顯著升高（t=27.714～48.853，P<0.001）。過表達(dá)miR-122-5p可抑制RA滑膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡（t=16.716～121.500，P<0.001）。miR-122-5p可抑制野生型DDR2細(xì)胞的熒光活性。過表達(dá)DDR2可以逆轉(zhuǎn)miR-122-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用（t=106.335～327.990，P<0.001）。結(jié)論miR-122-5p可抑制RA滑膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與靶向DDR2有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;微RNAs;盤狀結(jié)構(gòu)域受體2;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)]R593.22;R342.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2022）02-0289-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.074[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220412.1535.005.html;2022-04-1409：13：38

EFFECT OF MIR-122-5P ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS SYNOVIAL CELLS AND ITS MECHANISM GUO Zhanfei， WU Jie， YANG Xuehua， XU Zhendan， FAN Wenqiang， GAO Xiao （Department of Rheumatology and Immunology， The Fourth Clinical College of Xinxiang Medical College， Xinxiang Central Hospital， Xinxiang 453000， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-122-5p on the proliferation and apoptosis of rheumatoid arthritis （RA） synovial cells and it mechanism.MethodsQuantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-122-5p and DDR2 in normal synovial cells and RA synovial cells. The experiment was divided into negative control （miR-NC） group （transfected with mimic NC sequence）， miR-122-5p oligonucleotide analogue group （transfected with miR-122-5p mimics）， miR-122-5p specific oligonucleotide inhibitor negative control （anti-miR-NC） group， miR-122-5p specific oligonucleotide inhibitor （anti-miR-122-5p） group， miR-122-5p+pcDNA group （co-transfected with miR-122-5p mimics and empty vector pcDNA）， and miR-122-5p+pcDNA-DDR2 group （co-transfected with miR-122-5p mimics and DDR2 overexpression vector pcDNA-DDR2）， and RA synovial cells were transfected by lipofection. Western blot was used to measure the protein expression of DDR2， P21， and Survi-val; MTT assay was used to measure cell proliferation; flow cytometry was used to measure cell apoptosis; dual-luciferase reporter assay was used to measure the binding force of miR-122-5p and DDR2.ResultsCompared with the normal synovial cells， the RA synovial cells had a significant reduction in the expression of miR-122-5p and a significant increase in the expression of DDR2 （t=27.714-48.853，P<0.001）. Overexpression of miR-122-5p inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of RA synovial cells （t=16.716-121.500，P<0.001）， and miR-122-5p could inhibit the fluorescence activity of wild-type DDR2 cells. Overexpression of DDR2 reversed the effect of miR-122-5p in inhibiting the proliferation and promoting the apoptosis of RA synovial cells （t=106.335-327.990，P<0.001）. ConclusionThis experiment shows that miR-122-5p can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of RA synovial cells， possibly by targeting DDR2.

[KEY WORDS] arthritis， rheumatoid; microRNAs; discoidin domain receptor 2; cell proliferation; apoptosis

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種影響多個(gè)關(guān)節(jié)的全身自身免疫性疾病，其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)中滑膜細(xì)胞的增殖，而血管翳的形成可能導(dǎo)致潛在的軟骨破壞和骨侵蝕，以及促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，加快破壞進(jìn)程的發(fā)展[1-2]。RA的發(fā)病原因與其他自身免疫性疾病一樣，病因復(fù)雜多樣。臨床上的藥物以抑制免疫反應(yīng)、減輕炎癥為主，不能達(dá)到根治的目的，而且長(zhǎng)期使用對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的副作用較大[3-4]。因此，提高RA的治療效果成為該領(lǐng)域的一大難題。miRNA是由長(zhǎng)度為20個(gè)左右的核苷酸組成的短鏈內(nèi)源性非編碼的微小RAN分子，在機(jī)體各種疾病的發(fā)生中具有舉足輕重的作用[5]。據(jù)報(bào)道，miRNA在RA中也具有調(diào)控作用[6]，其中包括miR-122-5p[7]。盤狀結(jié)構(gòu)域受體激酶（DDR2）屬于受體激酶酪氨酸的一種，大量研究顯示，其在RA中具有重要的促炎作用[8]。本研究擬以RA病人滑膜細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)miR-122-5p和DDR2在滑膜細(xì)胞的表達(dá)，并觀察調(diào)控 miR-122-5p和DDR2表達(dá)對(duì)該細(xì)胞增殖、凋亡的影響，揭示miR-122-5p與DDR2的靶向關(guān)系，旨在為RA的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本文所用組織標(biāo)本，均來自新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的8例RA病人及意外交通事故導(dǎo)致關(guān)節(jié)粉碎性骨折的5例病人。DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;甲基噻唑基四唑（MTT）試劑購(gòu)自美國(guó)Sellect公司;Lipofectamine2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司;Trizol液購(gòu)自北京百奧萊博;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光液和放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）蛋白裂解液等均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組處理按照梁曉輝等[9]報(bào)道的方法，取新鮮滑膜組織剪碎，用DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶消化后進(jìn)行分離培養(yǎng)RA滑膜細(xì)胞和正常滑膜細(xì)胞。將miR-122-5p寡核苷酸模擬物（miR-122-5p mimics）及陰性對(duì)照mimic NC序列（miR-NC）、miR-122-5p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-122-5p）及其陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-122-5p mimics+空載體（pcDNA）、miR-122-5p mimics+DDR2過表達(dá)載體（pcDNA-DDR2）用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至RA滑膜細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別標(biāo)記為miR-NC組（A組）、miR-122-5p組（B組）、anti-miR-NC組（C組）、anti-miR-122-5p組（D組）、miR-122-5p+pcDNA組（E組）和miR-122-5p+pcDNA-DDR2組（F組）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)細(xì)胞中miR-122-5p和DDR2的表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞樣本總RNA，并用Nano-Drop 2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。DNase Ⅰ 消化RNA中可能污染的DNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板鏈cDNA。按擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值，反應(yīng)結(jié)束后分析Ct值，以2-△△Ct法計(jì)算miR-122-5p和DDR2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中DDR2、P21和Survival的蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解20～30 min。以12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉將膜封閉2 h;洗膜，加入一抗，4 ℃過夜孵育;洗膜，加二抗，4 ℃孵育2 h。加發(fā)光液，曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖調(diào)整細(xì)胞密度至10/L，然后接種至96孔板中，取適量的細(xì)胞（每孔1 000個(gè)），每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，孵育4 h。終止細(xì)胞培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加入150 μL的DMSO，振蕩使結(jié)晶充分融解，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞吸光度（OD490）。細(xì)胞增殖能力與細(xì)胞的吸光度值呈正比。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，用500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，首先加入5 μL的Annexin V-FITC避光反應(yīng)20 min，然后再加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min，最后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力將熒光素酶報(bào)告載體（psiCHECK2-DDR2-WT，psiCHECK2-DDR2-MUT）分別加入用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR-122-5p mi-mics和miR-NC的 RA滑膜細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果以海腎熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值表示miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，不同組別、不同時(shí)間及其二者交互的細(xì)胞活性比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-122-5p和DDR2在RA滑膜細(xì)胞表達(dá)

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正?；ぜ?xì)胞組相比較，RA滑膜細(xì)胞組細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)顯著降低，DDR2 的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（t=27.714～48.853，P<0.001）。見圖1和表1。

2.2過表達(dá)miR-122-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響

MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡結(jié)果顯示，不同時(shí)間、不同組別及其二者交互作用下OD比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與miR-NC組相比較，miR-122-5p組RA滑膜細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)顯著升高，48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖顯著降低、細(xì)胞凋亡率顯著升高，P21和Survival蛋白表達(dá)均顯著降低（t=16.716～121.500，P<0.001）。見圖2和表2。

2.3miR-122-5p與DDR2的結(jié)合力檢測(cè)

miR-122-5p靶向DDR2的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，DDR2與miR-122-5p的5′端存在8個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列（見圖3）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p組WT-DDR2細(xì)胞的熒光活性顯著降低（t=100.623，P<0.001），MUT-DDR2細(xì)胞的熒光活性無顯著變化。見表3。與anti-miR-NC組（1.00±0.01）相比，anti-miR-122-5p組（1.89±0.13）細(xì)胞中DDR2蛋白表達(dá)顯著升高，與miR-NC組（1.01±0.01）相比，miR-122-5p組（0.21±0.02）細(xì)胞中DDR2蛋白表達(dá)顯著降低（F=969.103，P<0.001）。見圖4。

2.4DDR2過表達(dá)對(duì)miR-122-5p調(diào)控RA滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響

不同時(shí)間、不同組別及二者交互作用下OD490比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與miR-122-5p+pcDNA組相比，miR-122-5p+pcDNA-DDR2組細(xì)胞中DDR2蛋白表達(dá)顯著升高，48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖顯著升高、細(xì)胞凋亡率顯著降低，P21和Survival蛋白表達(dá)均顯著升高（t=106.335～327.990，P<0.001）。見表4和圖5。

3討論

miRNA在包括RA的多種疾病中具有重要的作用[10]。如miR-146a、miR-203和miR-223等在關(guān)節(jié)炎中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11-13]。WANG等[14]使用miRNA陣列技術(shù)篩選RA病人血漿中的差異miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-122-3p的表達(dá)水平明顯降低。張瑩瑩等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，miR-122-3p在RA病人血漿中異常降低。研究顯示，ANRIL可以通過miR-122-5p/DUSP4軸調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的增殖和凋亡[16-22]。但關(guān)于miR-122-5p在RA中的作用及其對(duì)滑膜細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道。本研究檢測(cè)了RA病人滑膜細(xì)胞中miR-122-5p的表達(dá)，研究結(jié)果顯示，miR-122-5p低表達(dá)。進(jìn)一步過表達(dá)miR-122-5p后的結(jié)果顯示，RA滑膜細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，P21和Survival蛋白表達(dá)均顯著降低，說明過表達(dá)miR-122-5p可抑制RA滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。這為RA病人滑膜病變機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為miRNA在RA中的診斷和治療研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

DDR2為酪氨酸激酶受體家族成員之一，其在RA滑膜組織中的表達(dá)異常升高，對(duì)軟骨細(xì)胞具有破壞作用[23]。抑制DDR-2可降低關(guān)節(jié)炎模型小鼠炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞嚴(yán)重程度[24-27]。此外，研究發(fā)現(xiàn)DDR2-CYR61-MMP1信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲，促進(jìn)RA的骨侵蝕[28]。本文研究結(jié)果也顯示，RA滑膜細(xì)胞中DDR2高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[23]，這為探索DDR2在RA中的功能提供了體外研究的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，miR-122-5p靶向負(fù)調(diào)控DDR2的表達(dá)，以及過表達(dá)DDR2可抑制miR-122-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，這說明不僅miR-122-5p可靶向調(diào)控DDR2的表達(dá)，而且DDR2也可逆向調(diào)控miR-122-5p的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)RA的調(diào)控功能。這為miR-122-5p在RA治療中的潛在價(jià)值開發(fā)提供了更充分的理論依據(jù)。

綜上所述，miR-122-5p可抑制RA滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與miR-122-5p靶向調(diào)控DDR2有關(guān)，本研究結(jié)果為RA治療提供了新的方向。但miR-122-5p上游基因是如何調(diào)控其表達(dá)及其在RA發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未明確。

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