丹參多酚酸鹽對心肌細(xì)胞氧化損傷模型大鼠的作用

高洪瑞　閆慧　潘洋　郝巖　李健

[摘要]目的探討丹參多酚酸鹽對黃曲霉素B1（AFB1）誘導(dǎo)下大鼠心肌細(xì)胞（H9C2細(xì)胞）氧化應(yīng)激損傷的影響。方法用不同濃度的AFB1處理H9C2細(xì)胞，通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力以確定最佳氧化損傷模型AFB1濃度（128 μmol/L）。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組（用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞）、AFB1誘導(dǎo)模型組（在正常對照組基礎(chǔ)上加入128 μmol/L AFB1）和低、中、高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組（128 μmol/L AFB1+丹參多酚酸鹽濃度分別為5、20、40 mg/L）。采用CCK-8法測定各組細(xì)胞的存活率，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，Western blot方法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白過氧化物歧化酶2（SOD2）和過氧化氫酶（CAT）蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常對照組比較，AFB1誘導(dǎo)模型組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞相對存活率降低，細(xì)胞內(nèi)ROS升高，細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT蛋白表達(dá)降低;與AFB1誘導(dǎo)模型組相比較，高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組的細(xì)胞形態(tài)有所改善，細(xì)胞相對存活率增加，細(xì)胞內(nèi)ROS明顯降低，SOD2、CAT蛋白表達(dá)有所上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.023～226.937，P<0.05）。結(jié)論丹參多酚酸鹽可通過改善抗氧化酶活力、減少ROS的產(chǎn)生、減少氧化應(yīng)激損傷，改善AFB1誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷。

[關(guān)鍵詞]丹參多酚酸鹽;黃曲霉素B1;肌細(xì)胞，心臟;氧化性應(yīng)激;活性氧

[中圖分類號]R542.2;R282.71[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0189-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.040[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1334.009.html;2022-03-1413：57：22

EFFECT OF SALVIANOLATE ON MODEL RATS WITH OXIDATIVE DAMAGE OF CARDIOMYOCYTES? GAO Hongrui， YAN Hui， PAN Yang， HAO Yan， LI Jian（Medical Colleage of Qingdao University，? Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo study the effect of salvianolate on oxidative damage of rat cardiomyocytes （H9C2） induced by aflatoxin B1 （AFB1）. MethodsH9C2 cells were treated with different concentrations of AFB1， and the optimal concentration of AFB1 （128 μmol/L） for the oxidative damage model was determined by CCK-8 assay. H9C2 cells were divided into normal group （cultured in DMEM medium）， AFB1-induced model group （cultured in DMEM medium with 128 μmol/L AFB1）， and intervention groups with low， medium， and high concentrations of salvianolate （128 μmol/L AFB1 + 5， 20， and 40 mg/L salvianolate）. Cell survival rate was determined by CCK-8 assay. Morphological changes of cells were observed under an inverted phase contrast microscope. Intracellular reactive oxygen species （ROS） was detected by DCFH-DA staining. Western blot was used to measure the expression levels of stress-related superoxide dismutase 2 （SOD2） and catalase （CAT）. ResultsCompared with the normal group， the AFB1-induced model group showed significantly changed cell morphology， reduced cell survival rate， increased ROS production， and decreased protein expression of SOD2 and CAT. Compared with the AFB1-induced model group， the high-concentration salvianolate intervention group showed improved cell morphology， increased cell survival rate， significantly decreased ROS production， and up-regulated SOD2 and CAT （F=8.023-226.937，P<0.05）. ConclusionSalvianolate can ameliorate AFB1-induced H9C2 damage by increasing the activity of antioxidant enzymes and reducing ROS production and related oxidative stress.

[KEY WORDS]salvianolate; aflatoxin B1; myocytes， cardiac; oxidative stress; reactive oxygen species

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一類毒素，其中黃曲霉素B1（AFB1）毒性最大、危害最嚴(yán)重[1]，可對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，包括致癌、致突變和肝臟損傷等[2]。AFB1的主要靶器官是肝臟[3]，但一些研究表明，AFB1也會導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟損傷，其機(jī)制涉及線粒體損傷、活性氧（ROS）生成和細(xì)胞凋亡等[4-5]。丹參是一種傳統(tǒng)的中藥，具有活血化瘀之功效[6]，丹參多酚酸鹽是丹參的水溶性有效活性部分，有很強(qiáng)的抗氧化、抗凋亡、內(nèi)皮保護(hù)和舒張血管等作用[7]，臨床上主要應(yīng)用于冠心病的治療[8]。有研究表明，急性心肌梗死病人經(jīng)皮冠狀動脈介入治療圍術(shù)期靜脈輸注丹參多酚酸鹽可有效改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)心功能恢復(fù)，增加心肌灌注量[9]。但丹參多酚酸鹽對AFB1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的影響鮮有報(bào)道。本文研究通過AFB1誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞（H9C2細(xì)胞）制備氧化損傷模型，評估丹參多酚酸鹽對H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為丹參多酚酸鹽的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1細(xì)胞及試劑

H9C2細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司;AFB1（百靈威科技有限公司，純度98%）;丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，每瓶100 mg）;DMEM高糖培養(yǎng)液（美國HyClone公司）;胎牛血清（FBS，BI）;二甲基亞砜（DMSO）、5XTris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)液均購自北京索萊寶公司;CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、10×TBST均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;過氧化物歧化酶2（SOD2）抗體、過氧化氫酶（CAT）抗體（Anti-Catalase）均購自abcam公司;GAPDH（博奧森生物技術(shù)有限公司）;Anti-Rabbit IgG（H+L，Elabscience生物技術(shù)有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1H9C2細(xì)胞培養(yǎng)H9C2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組（用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞）、AFB1誘導(dǎo)模型組（在DMEM培養(yǎng)液中加入濃度128 μmol/L的AFB1）及低、中、高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組（在培養(yǎng)液中加入濃度128 μmol/L的AFB1+濃度分別為5、20、40 mg/L丹參多酚酸鹽）。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞相對存活率取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×10/L，接種于96孔板，每孔100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜（15～18 h），分組加藥。①設(shè)置正常對照組（H9C2細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)液）、DMSO組（DMEM培養(yǎng)液中加濃度2 g/L的DMSO）和AFB1組（AFB1終濃度分別為32、64、96、128、160、192 μmol/L）， 以細(xì)胞存活率接近50%為最佳的藥物造模濃度;②設(shè)置正常對照組（用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞）、不同濃度的丹參多酚酸鹽組（丹參多酚酸鹽濃度分別為5、10、20、40、50、60 mg/L），確定丹參多酚酸鹽的安全使用濃度;③設(shè)置正常對照組（用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞）和最佳濃度（128 μmol/L）AFB1+丹參多酚酸鹽組（丹參多酚酸鹽濃度分別為0、5、20、40 mg/L）。每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)36 h后，吸除原培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μL（含有CCK-8試劑10 μL）的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育1.5 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對存活率。細(xì)胞相對存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞長到70%～80%融合，吸去細(xì)胞上清液，按照“1.2.1”方法分組及處理36 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平取對數(shù)期生長的H9C2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種至96孔板，每孔5×10個細(xì)胞。孵育24 h后，吸除原培養(yǎng)液，按照 “1.2.1”方法分組并處理，每組設(shè)置6個復(fù)孔。藥物作用36 h后，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有DCFH-DA（10 μmol/L）探針的無血清培養(yǎng)液，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為502 nm，發(fā)射波長為530 nm），并應(yīng)用Image J軟件分析各組熒光強(qiáng)度。

1.2.5Western blot方法檢測抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平各組細(xì)胞干預(yù)36 h后，采用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，分別應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)0.10和0.15的SDS-PAGE對蛋白進(jìn)行分離，之后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。應(yīng)用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入1∶2 000的GAPDH、SOD2和CAT一抗，4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗（抗兔抗體，1∶5 000）37 ℃搖床上孵育1.5 h，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，并用Image J軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1最佳藥物造模濃度及丹參多酚酸鹽安全濃度

隨著AFB1濃度的升高，細(xì)胞相對存活率呈劑量依賴性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293.056，P<0.05）;當(dāng)AFB1的濃度達(dá)到128 μmol/L時，H9C2細(xì)胞相對存活率為56.83%，符合造模條件。故選擇AFB1濃度128 μmol/L作為造模濃度。與空白對照組相比，0～50 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細(xì)胞，細(xì)胞相對存活率無明顯變化（P>0.05）;60 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細(xì)胞，細(xì)胞相對存活率下降（F=2.387，P<0.05）。0～50 mg/L濃度的丹參多酚酸鹽為安全使用濃度。

2.2各組 H9C2細(xì)胞形態(tài)比較

空白對照組H9C2細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形，緊密連接，邊界清晰可見，貼壁牢固;AFB1誘導(dǎo)模型組H9C2細(xì)胞生長密度較低，細(xì)胞間空隙增加，可見大片細(xì)胞脫落，部分細(xì)胞收縮變圓、形狀不規(guī)則，可見細(xì)胞碎片;不同劑量丹參多酚酸鹽干預(yù)組H9C2細(xì)胞生長形態(tài)及狀態(tài)得到一定改善。見圖1。

2.3丹參多酚酸鹽對H9C2細(xì)胞損傷的影響

與空白對照組比較，AFB1誘導(dǎo)模型組細(xì)胞相對存活率降低;與AFB1誘導(dǎo)模型組相比較，高濃度的丹參多酚酸鹽干預(yù)組細(xì)胞相對存活率升高，差異有顯著性（F=226.937，P<0.05）。見表1。

2.4丹參多酚酸鹽對心肌細(xì)胞ROS水平影響

熒光顯微鏡下各組H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS觀察結(jié)果見圖2。與正常對照組相比，AFB1誘導(dǎo)模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高;與AFB1誘導(dǎo)模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組ROS水平顯著降低，差異有顯著性（F=62.751，P<0.05）。見表1。

2.5各組抗氧化蛋白SOD2和CAT表達(dá)比較

與正常對照組比較，AFB1誘導(dǎo)模型組心肌細(xì)胞SOD2、CAT蛋白表達(dá)降低;與AFB1誘導(dǎo)模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組SOD2、CAT蛋白表達(dá)增加，差異有顯著意義（F=12.090、8.023，P<0.05）。見表1。

3討論

AFB1是毒性最強(qiáng)、最常見的黃曲霉毒素，被歸類為第一類致癌物。既往研究表明，AFB1誘導(dǎo)毒性的原因之一是氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激導(dǎo)致抗氧化酶活力降低及ROS過量生成，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷[10]。也有研究表明，AFB1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體損傷從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[4-5]。丹參多酚酸鹽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，其可通過降低ROS水平，穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位，改善與恢復(fù)細(xì)胞功能活性[11]。有研究表明，丹參多酚酸鹽可抑制HO處理的大鼠心肌細(xì)胞ROS的過量生成[11]，可通過抑制氧化損傷來防治HO所致的大鼠心肌細(xì)胞重構(gòu)[12]。本研究以128 μmol/L濃度的AFB1作用大鼠H9C2細(xì)胞制備心肌細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AFB1誘導(dǎo)模型組心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞相對存活率顯著降低，提示AFB1對心肌細(xì)胞有明顯的毒性作用;與AFB1誘導(dǎo)模型組相比，應(yīng)用高濃度丹參多酚酸鹽（40 mg/L）干預(yù)H9C2細(xì)胞36 h，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量有所改善，細(xì)胞相對存活率增加，說明高濃度的丹參多酚酸鹽對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

ROS是一種氧化能力較強(qiáng)的自由基，包括超氧離子（O）、羥基自由基（-OH）、過氧化氫（HO）和單線態(tài)氧（O）等。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的各種抗氧化劑和抗氧化酶如谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、SOD、CAT等可使體內(nèi)ROS的生成和消除處于平衡狀態(tài);在病理?xiàng)l件下，ROS產(chǎn)生過多會打破氧化系統(tǒng)/抗氧化系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。其中SOD是人體內(nèi)天然的抗氧化酶，可催化超氧化物自由基生成氧或HO，然后通過GPX和CAT催化反應(yīng)將HO分解為水和氧，有效清除多余ROS，維持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡，其活性高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AFB1誘導(dǎo)模型組ROS升高，SOD2、CAT蛋白表達(dá)降低，提示AFB1處理心肌細(xì)胞后，破壞了氧化/抗氧化的平衡機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基的異常累積;與AFB1誘導(dǎo)模型組比較，高濃度的丹參多酚酸鹽干預(yù)組心肌細(xì)胞ROS降低，SOD2、CAT蛋白表達(dá)增加，表明丹參多酚酸鹽可能通過減少過量的ROS產(chǎn)生、改善抗氧化酶活力、降低氧化應(yīng)激損傷來抑制AFB1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，丹參多酚酸鹽對AFB1損傷的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善SOD2、CAT等抗氧化酶活力，進(jìn)而促進(jìn)過量ROS的清除，減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究可為臨床防治心臟損傷相關(guān)疾病提供新思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]黃豐，肖德強(qiáng)，高偉，等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對黃曲霉毒素B1致肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019，36（5）：696-700.

[2]師文文，呂攀，徐慶強(qiáng)，等. 油酸在黃曲霉毒素誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)， 2019，41（2）：267-274.

[3]LI Y， MA Q G， ZHAO L H， et al. Protective efficacy of alpha-lipoic acid against Aflatoxin B1-induced oxidative damage in the liver[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences， 2014，27（6）： 907-915.

[4]WANG W J， XU Z L， YU C， et al. Effects of aflatoxin B1 on mitochondrial respiration， ROS generation and apoptosis in broiler cardiomyocytes[J]. Nihon Chikusan Gakkaiho， 2017，88（10）：1561-1568.

[5]GE J H， YU H C， LI J， et al. Assessment of aflatoxin B1 myocardial toxicity in rats： mitochondrial damage and cellular apoptosis in cardiomyocytes induced by aflatoxin B1[J]. The Journal of International Medical Research， 2017，45（3）：1015-1023.

[6]周斌，趙芳，陳明，等.丹參多酚酸鹽對高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用[J]. 廣東醫(yī)學(xué)， 2013，34（20）：3105-3108.

[7]REN J， FU L， NILE S H， et al. Salvia miltiorrhiza in treating cardiovascular diseases： a review on its pharmacological and clinical applications[J]. Frontiers in Pharmacology， 2019，10：753.

[8]QI J Y， YU J， HUANG D H， et al. Salvianolate reduces murine myocardial ischemia and reperfusion injury via ERK1/2 signaling pathways in vivo[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2017，23（1）：40-47.

[9]ZHANG Q， JIAO F J， HUA C J. Perioperative application of salvianolate on oxidative stress and plasma IMD/ADM2 in patients with acute myocardial infarction undergoing PCI[J]. Experimental and Therapeutic Medicine， 2017，13（4）：1475-1479.

[10]MANNAA F A， ABDEL-WAHHAB K G， ABDEL-WAHHAB M A. Prevention of cardiotoxicity of aflatoxin B1 via die-tary supplementation of Papaya fruit extracts in rats[J]. Cytotechnology， 2014，66（2）： 327-334.

[11]呂林林，安姿旖，梁家健，等. 丹參多酚酸鹽對過氧化氫誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志， 2019，35（5）：865-872.

[12]費(fèi)愛華，陳淼，潘曙明. 丹參多酚酸鹽對心肌細(xì)胞TGF-β信號通路的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2014，23（19）：2053-2055，2058.

（本文編輯黃建鄉(xiāng)）