亮氨酸通過上調(diào)糖氧剝奪損傷皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α 表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

姚旭進(jìn)　任近陽　孔祥一　孫江東　林韜　萬芪

[摘要]目的研究亮氨酸（Leu）對糖氧剝奪（OGD）損傷皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用以及Leu對低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）水平的調(diào)節(jié)。方法將OGD處理的皮質(zhì)神經(jīng)元作為腦缺血體外模型。采用CCK-8比色法、乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)、臺盼藍(lán)染色法檢測Leu處理后損傷神經(jīng)元的存活變化;采用免疫印跡法（Western blot）檢測OGD損傷后、Leu處理后神經(jīng)元中HIF-1α蛋白表達(dá)水平;利用DMOG、BAY87-2243分別激動或抑制HIF-1α，觀察HIF-1α表達(dá)水平對Leu的神經(jīng)保護(hù)作用的影響。結(jié)果OGD損傷后，補(bǔ)充Leu能增加神經(jīng)元存活率，降低LDH釋放率和臺盼藍(lán)染色陽性率（F=76.69～236.30，P<0.01）。Leu能上調(diào)正常神經(jīng)元HIF-1α表達(dá)水平（t=11.03，P<0.05）。OGD損傷后，神經(jīng)元中HIF-1α的表達(dá)增加（F=183.40，P<0.01）。Leu能上調(diào)損傷皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α的表達(dá)水平（F=241.80，P<0.01）。HIF-1α水平降低能抑制Leu上調(diào)的細(xì)胞存活率和下調(diào)的LDH釋放率、臺盼藍(lán)染色陽性率，HIF-1α水平升高能促進(jìn)Leu上調(diào)的細(xì)胞存活率和下調(diào)的LDH釋放率、臺盼藍(lán)染色陽性率（F=84.30～320.70，P<0.01）。結(jié)論皮質(zhì)神經(jīng)元在OGD損傷后，補(bǔ)充Leu可通過提高HIF-1α表達(dá)水平增加神經(jīng)元存活率。

[關(guān)鍵詞]亮氨酸;低氧誘導(dǎo)因子1，α亞基;大腦皮質(zhì);神經(jīng)保護(hù)

[中圖分類號]R977.4;R338.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0159-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.068[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220320.1554.015.html;2022-03-2209：40：47

NEUROPROTECTIVE EFFECT OF LEUCINE ON OXYGEN-GLUCOSE DEPRIVATION-INJURED CORTICAL NEURONS THROUGH UPREGULATING HIF-1α EXPRESSION YAO Xujin， REN Jinyang， KONG Xiangyi， SUN Jiangdong， LIN Tao， WAN Qi （The Institute of Neuroregeneration and Neurorehabilitation， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of leucine （Leu） on oxygen-glucose deprivation （OGD）-injured cortical neurons and the regulation of hypoxia-inducible factor 1， alpha subunit （HIF-1α） by Leu. MethodsOGD-treated cortical neurons were used as an in vitro model for cerebral ischemia. Cell Counting Kit-8 assay， lactate dehydrogenase （LDH） release assay， and trypan blue staining were performed to determine the neuron survival after Leu treatment. Western blot was used to measure the HIF-1α level in neurons after OGD injury and after Leu treatment. DMOG and BAY87-2243 were used as an agonist and an antagonist of HIF-1α， respectively， to observe the effect of HIF-1α level on the neuroprotective effect of Leu. ResultsAfter OGD injury， supplementation with Leu significantly increased neuronal viability and significantly reduced LDH release rate and trypan blue positive rate （F=76.69-236.30，P<0.01）. Leu significantly upregulated HIF-1α expression in normal neurons （t=11.03，P<0.05）. After OGD injury， HIF-1α expression in neurons significantly increased （F=183.40，P<0.01）. Leu significantly upregulated HIF-1α expression in OGD injured neurons （F=241.80，P<0.01）. Downregulating HIF-1α inhibited Leu-increased cell viability and Leu-reduced LDH release rate and trypan blue positive rate， while upregulating HIF-1α promoted Leu-increased cell viability and Leu-reduced LDH release rate and trypan blue positive rate （F=84.30-320.70，P<0.01）. ConclusionAfter OGD injury of cortical neurons， supplementation with Leu can increase neuronal viability through upregulating HIF-1α expression.

[KEY WORDS]leucine;? hypoxia-inducible factor 1， alpha subunit; cerebral cortex; neuroprotection

缺血性腦卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的腦血管疾病[1]。大腦局部的血液供應(yīng)不足或停滯，會使相應(yīng)部位的神經(jīng)元周圍形成低氧狀態(tài)。低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）將在低氧條件下表達(dá)積累。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α通過對其下游靶基因的調(diào)控，在血管再生、炎癥、細(xì)胞增殖分化及腫瘤生長等方面均起到重要的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明，穩(wěn)定HIF-1α具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。亮氨酸（Leu）作為一種支鏈氨基酸發(fā)揮著重要作用，已有研究表明，Leu能促進(jìn)顱腦損傷病人認(rèn)知功能的康復(fù)以及營養(yǎng)水平的提高[3]，但其在腦缺血中的研究甚少。本研究利用糖氧剝奪（OGD）處理的皮質(zhì)神經(jīng)元作為體外腦缺血模型，探究Leu對OGD損傷皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用，以及Leu對HIF-1α水平的調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級、孕18 d的健康SD大鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，動物合格證號SCXK（魯）2014007，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)試劑neurobasal me-dium、B-27 Supplement、DMEM-H-Glucose、Trypsin-EDTA、HEPES、glutaMax 100×、青霉素-鏈霉素（100×）均購自Gibico公司;胎牛血清購自四季青公司;抗HIF-1α兔單克隆抗體、抗β-actin兔單克隆抗體、抗MAP2小鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司;臺盼藍(lán)、抗熒光衰減封片劑（含有DAPI）、二甲基亞砜（DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級）、DMOG購自CSNpharm公司;PMSF（0.1 mol/L）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（All-in-one，100×）購自北京索萊寶科技有限公司;多聚賴氨酸購自美國Sigma公司;BAY87-2243、RIPA裂解液以及乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;增強(qiáng)型CCK-8試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原代神經(jīng)元培養(yǎng)取孕18 d的健康SD大鼠，用異氟烷氣體麻醉后脫頸處死，取出胎鼠，用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇消毒后置于冰上。在光學(xué)顯微鏡下剝離顱骨、腦膜，機(jī)械分離大腦皮質(zhì)，暫時存放于DMEM培養(yǎng)液中。以900 r/min離心5 min，棄上清，加入0.5 g/L胰蛋白酶消化20 min，加入胎牛血清終止消化。以900 r/min離心5 min，棄上清，加入無血清培養(yǎng)液（neurobasal medium 50 mL，含有B-27 Supplement 1 mL、glutaMax 100×0.5 mL、青霉素-鏈霉素（100×）0.5 mL），反復(fù)緩慢吹打，濾布過濾。將細(xì)胞以1.2×10⁵/cm² 的密度接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿和孔板中，此后每3 d更換無血清培養(yǎng)液1次。

1.2.2OGD/再灌注損傷模型制備原代神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗 2 次，Sham組加入有糖細(xì)胞外液，OGD組加入無糖細(xì)胞外液。然后將OGD組神經(jīng)元置于 37 ℃厭氧箱中低氧處理1 h（氣體參數(shù)設(shè)置為體積分?jǐn)?shù)0.01 O2+體積分?jǐn)?shù)0.94 N₂+體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂），將Sham組神經(jīng)元置于正常培養(yǎng)箱中。氧處理結(jié)束后，將各組培養(yǎng)液換為等體積無血清培養(yǎng)液。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組為了探討Leu對OGD損傷神經(jīng)元存活的作用，實(shí)驗(yàn)分為Control組、OGD 3 h組、OGD 3 h+Leu組、OGD 6 h組、OGD 6 h+Leu組。為了探討Leu對正常皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)的作用，實(shí)驗(yàn)分為Control組、Leu組。為了探討OGD損傷神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)的變化，實(shí)驗(yàn)分為Control組、Sham 3 h組、OGD 3 h組、Sham 6 h組和OGD 6 h組。為了探討Leu對OGD損傷皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α蛋白表達(dá)的作用，實(shí)驗(yàn)分為Control組、OGD組和OGD+Leu組。為了探討HIF-1α水平對Leu調(diào)節(jié)的損傷神經(jīng)元存活的影響，實(shí)驗(yàn)分為Control組（A組）、OGD組（B組）、OGD+Leu組（C組）、OGD+Leu+DMOG組（D組）、OGD+Leu+BAY87-2243組（E組）。50 μmol/L Leu在復(fù)氧時加入;100 μmol/L DMOG和BAY87-2243在復(fù)氧開始時加入。后面兩個實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)含量及免疫熒光檢測均在OGD后3 h進(jìn)行。

1.2.4HIF-1α蛋白的免疫印跡法（Western blot）檢測相應(yīng)各組在復(fù)氧 3、6 h時提取蛋白質(zhì)。用RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞，離心后取上清，提取各組神經(jīng)元細(xì)胞蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。配制相應(yīng)的分離膠和濃縮膠，按每孔10 μg 蛋白計算上樣量，電泳后轉(zhuǎn)移至PDVF膜上。以含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，再分別加入抗HIF-1α兔單克隆抗體、抗β-actin兔單克隆抗體（均1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。以TBST溶液清洗PDVF膜3次，每次10 min，然后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h。以TBST溶液清洗PDVF膜3次，每次10 min，用ECL發(fā)光劑顯影。采用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，以HIF-1α和β-actin條帶灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值。

1.2.5神經(jīng)元存活檢測分別采用免疫熒光染色法、CCK-8比色法、LDH釋放實(shí)驗(yàn)、臺盼藍(lán)染色法檢測神經(jīng)元存活變化。

1.2.5.1免疫熒光染色法用PBS漂洗細(xì)胞片3次，每次5 min，每孔加入40 g/L細(xì)胞組織固定液200 μL，室溫固定20 min;以PBS漂洗細(xì)胞片3次，每次5 min，每孔加入含有2.5 g/L Triton X-100、30 g/L牛血清清蛋白（BSA）的封閉液200 μL，室溫封閉1 h;每孔加封閉液200 μL并加入抗MAP2小鼠單克隆抗體（1∶500稀釋）， 4 ℃孵育過夜。次日于室溫下以PBST 漂洗3次，每次5 min;每孔加入約 200 μL 熒光二抗避光室溫孵育2 h后，以PBS漂洗 3次，每次5 min。封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.5.2CCK-8比色法在復(fù)氧24 h后檢測神經(jīng)元存活率。更換新培養(yǎng)液后，每孔加入CCK-8溶液（避免氣泡產(chǎn)生）10 μL，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.2.5.3LDH釋放實(shí)驗(yàn)在復(fù)氧24 h后檢測神經(jīng)元LDH釋放率。更換新培養(yǎng)液后，每孔加入 10 μL的LDH釋放劑，搖勻，繼續(xù)放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。1 h后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔離心機(jī)離心 5 min，分別取上清120 μL，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定，判斷細(xì)胞死亡變化。

1.2.5.4臺盼藍(lán)染色法在復(fù)氧24 h后檢測神經(jīng)元臺盼藍(lán)染色陽性率。皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，未著色細(xì)胞為存活細(xì)胞。隨機(jī)計數(shù)15個細(xì)胞視野，計算臺盼藍(lán)染色陽性率。臺盼藍(lán)染色陽性率=（藍(lán)色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 7.0軟件對所得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn);多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Leu對OGD損傷神經(jīng)元存活的影響

OGD損傷及加入Leu后，培養(yǎng)神經(jīng)元的存活變化見圖1。各組神經(jīng)元存活率、LDH釋放率、臺盼藍(lán)染色陽性率比較差異均有顯著性（F=76.69～236.30，P<0.01）。OGD 3 h+Leu組與OGD 3 h組相比較，細(xì)胞存活率增加（t=14.82，P<0.05），LDH釋放率和臺盼藍(lán)染色陽性率降低（t=5.31、4.54，P<0.05）。OGD 6 h+Leu組與OGD 6 h組相比，細(xì)胞存活率增加（t=5.78，P<0.05），LDH釋放率和臺盼藍(lán)染色陽性率降低（t=3.64、3.07，P<0.05）。見表1。

2.2Leu對正常神經(jīng)元HIF-1α表達(dá)的影響

Control組和Leu組正常皮質(zhì)神經(jīng)元的HIF-1α蛋白表達(dá)水平分別為0.27±0.05和0.66±0.07（n=6），Leu組HIF-1α蛋白表達(dá)水平較Control組明顯上升（t=11.03，P<0.05）。見圖2。

2.3OGD損傷神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α水平變化

Western blot檢測結(jié)果顯示，各組皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α蛋白的表達(dá)水平比較差異有顯著性（n=6，F(xiàn)=183.40，P<0.01）。OGD 3 h組（0.97±0.14）與Sham 3 h組（0.23±0.04）相比，HIF-1α蛋白表達(dá)明顯上升（t=13.74，P<0.05）;OGD 6 h組（1.35±0.13）與Sham 6 h組（0.27±0.05）相比， HIF-1α蛋白表達(dá)也明顯上升（t=20.03，P<0.05）。見圖3。

2.4Leu對OGD損傷神經(jīng)元HIF-1α表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，各組皮質(zhì)神經(jīng)元HIF-1α蛋白的表達(dá)水平比較差異有顯著性（n=6，F(xiàn)=241.80，P<0.01）。在OGD 3 h后，OGD+Leu組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平（1.52±0.104）與OGD組（1.09±0.15）相比明顯上升（t=5.84，P<0.05）。見圖4。

2.5HIF-1α水平對Leu調(diào)節(jié)的損傷神經(jīng)元存活的影響

利用DMOG、BAY87-2243作為HIF-1α的激動劑和抑制劑分別激動和抑制HIF-1α，檢測Leu保護(hù)作用的變化[4-5]。各組培養(yǎng)神經(jīng)元的存活變化見圖5。各組神經(jīng)元存活率、LDH釋放率、臺盼藍(lán)染色陽性率比較差異有顯著性（F=84.30～320.70，P<0.01）。與OGD+Leu 組相比較，OGD+Leu+DMOG組的細(xì)胞存活率升高（t=6.37，P<0.05），LDH釋放率和臺盼藍(lán)染色陽性率均明顯降低（t=3.56、3.84，P<0.05）;OGD+Leu+BAY87-2243組細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低（t=18.22，P<0.05），LDH釋放率和臺盼藍(lán)染色陽性率增高（t=5.67、7.15，P<0.05）。見表2。

3討論

缺血性腦卒中是一種極易致殘、致死的腦血管疾病[1]。一直以來，雖有大量的研究，但該病仍未有理想的治療方案。目前，除了靜脈溶栓、血管內(nèi)介入外，神經(jīng)保護(hù)治療也取得很大的進(jìn)展[6]。

Leu是人體必需的支鏈氨基酸。食物補(bǔ)充的Leu能通過血-腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)里，Leu通過調(diào)節(jié)谷氨酸/谷氨酰胺的氮質(zhì)傳遞，參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成。有研究表明，血液中水平升高的Leu會通過激活下丘腦區(qū)域的神經(jīng)元內(nèi)的mTOR通路，調(diào)控食欲與攝食[8-9]。持續(xù)補(bǔ)充Leu可以提高骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的合成代謝，并提高肌肉質(zhì)量。臨床研究發(fā)現(xiàn)，高Leu營養(yǎng)補(bǔ)充有助于癌癥病人運(yùn)動能力的改善[10-12]。在C2C12細(xì)胞內(nèi)，Leu通過SIRT1-AMPK通路促進(jìn)線粒體內(nèi)的生物合成。已知Leu能有效干預(yù)腦缺血損傷后的自噬病變[13-14]。Leu作為mTOR信號通路的重要調(diào)控因子，在小腸表皮細(xì)胞中能降低活性氧（ROS）水平，并通過mTOR-HIF-1α通路使氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解[15-17]。

在正常情況下，HIF的α亞基可被脯氨酰-羥化酶快速羥基化[18]，進(jìn)而進(jìn)一步被降解。因此，正常狀態(tài)下HIF-1α的含量低[19]。在低氧條件下，HIF-1α降解受阻，可在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)各種下游靶基因轉(zhuǎn)錄。HIF-1α神經(jīng)細(xì)胞特定缺陷的小鼠常伴有腦積水、記憶衰退等癥狀[20]。在腫瘤中，HIF-1α可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，引起腫瘤血管的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[21]。在顱腦損傷中，低氧預(yù)處理可通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，提高腦組織對低氧耐受能力及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活化，進(jìn)而減輕損傷[22-23]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氧適應(yīng)通過激活上調(diào)HIF-1α表達(dá)，明顯降低OGD導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)作用[24]?？傊?，在損傷早期，HIF-1α被認(rèn)為具有保護(hù)作用[25]。

本研究通過培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元，采用OGD/再灌注建立體外模型，證實(shí)了Leu對缺血性腦損傷神經(jīng)元的作用及其靶點(diǎn)。OGD損傷后，神經(jīng)元中HIF-1α蛋白水平隨時間延長而增加。Leu處理進(jìn)一步上調(diào)了HIF-1α表達(dá)水平，使神經(jīng)元存活率上升。并且利用HIF-1α抑制劑和激動劑證明了Leu通過HIF-1α發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。已知Leu具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)降解的功能，它可能通過激活mTOR，進(jìn)一步促進(jìn)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄[26]，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)水平。蓄積的HIF-1α能夠觸發(fā)與糖酵解、葡萄糖代謝、線粒體功能、細(xì)胞生存等相關(guān)的基因的表達(dá)。還有研究表明，HIF-1α可以促進(jìn)紅細(xì)胞生成素（Epo）和VEGF的表達(dá)[27]，而Epo、VEGF已知對缺血性腦損傷具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，能減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，縮小腦梗死體積。另一種可能是，上調(diào)的HIF-1α通過抑制P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少OGD引起的神經(jīng)元死亡[28]。補(bǔ)充Leu也可能通過促進(jìn)mTOR、減弱LC3-Ⅱ的表達(dá)，對自噬起一定抑制作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[29]。Leu還有許多其他作用，例如作為一種特殊的生酮氨基酸，Leu會被代謝成乙酰輔酶A，而后者是一種直接供應(yīng)三羧酸循環(huán)的能源物質(zhì)。乙酰輔酶A是組蛋白乙?；幸阴；膩碓?，因此，Leu也可能通過影響細(xì)胞表觀遺傳對OGD損傷后的神經(jīng)元產(chǎn)生作用[30]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明Leu通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)對OGD/再灌注損傷的皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。Leu作為人體必需的氨基酸，廣泛存在于各種蛋白類食物中，并且是術(shù)后腸外營養(yǎng)的必要成分之一。深入研究Leu對缺血性腦損傷的作用及潛在機(jī)制對該病病人的早期藥物治療以及營養(yǎng)補(bǔ)充具有重要意義。但是本研究僅在細(xì)胞層面初步探究了Leu對腦缺血后神經(jīng)元的作用及可能機(jī)制，其具體作用機(jī)制以及動物實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯馬偉平）