基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療子宮內(nèi)膜癌的機(jī)制

姜丕雨　李康康　周靜祎　王雪蓮　程明陽(yáng)　陳雪紅

[摘要]目的采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃芪治療子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制。方法應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）篩選出黃芪潛在活性成分，在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）和Genecards等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索子宮內(nèi)膜癌的靶點(diǎn)信息。基于Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，使用插件Biogenet和Merge功能獲得黃芪治療子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，應(yīng)用Metascape軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果獲得黃芪有效成分17個(gè)，藥物靶點(diǎn)198個(gè)，子宮內(nèi)膜癌靶點(diǎn)1 845個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)238個(gè)，KEGG通路151條，關(guān)鍵生物學(xué)通路有細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和癌癥通路等。結(jié)論黃芪通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路的方式來(lái)干預(yù)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);黃芪;子宮內(nèi)膜腫瘤

[中圖分類號(hào)]R282.71[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2022）02-0242-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.045[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1333.002.html;2022-03-1414：19：13

MECHANISM OF ACTION OF ASTRAGALI RADIX IN TREATMENT OF ENDOMETRIAL NEOPLASMS： A STUDY BASED ON NETWORK PHARMACOLOGY JIANG Piyu， LI Kangkang， ZHOU Jingyi， WANG Xuelian， CHENG Mingyang， CHEN Xuehong （Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the mechanism of action of Astragali Radix in the treatment of endometrial neoplasms （EN） based on network pharmacology. MethodsThe active ingredients of Astragali Radix were identified using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology （TCMSP） database. The targets of EN were searched for in Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM） and Genecards. Cytoscape 3.7.0 was used to construct an “active ingredient-target” network. Biogenet and Merge were used to obtain the key targets involved in EN treatment with Astragali Radix. Metascape was used to perform GO and KEGG enrichment analyses of the key targets. ResultsThere were 17 active ingredients in Astragali Radix， 198 drug targets， 1 845 EN targets， 238 key targets， and 151 KEGG pathways. The key biological pathways included cell cycle， DNA repair， apoptosis， and cancer pathway. ConclusionAstragali Radix interferes with the development and progression of EN with multiple components， targets， and pathways.

[KEY WORDS]network pharmacology; astragalus propinquus; endometrial neoplasms

子宮內(nèi)膜癌（EN）是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，且近幾年EN的發(fā)病率逐漸上升[1]。EN發(fā)病與多種因素有關(guān)，目前針對(duì)EN治療以手術(shù)為主，輔以放療和化療[2]。但化療藥物具有較強(qiáng)的毒副作用，而中藥抗腫瘤具有多靶點(diǎn)、多方位以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上已成為腫瘤治療的重要研究方向[3]。近年來(lái)臨床上將黃芪應(yīng)用于多種腫瘤的治療，效果顯著，且有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明黃芪對(duì)EN細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用[4]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)地探究黃芪的有效活性成分、潛在作用靶點(diǎn)以及調(diào)控的通路信息，為黃芪治療EN提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1黃芪成分篩選

以“黃芪”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為活性成分篩選條件，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）[5]數(shù)據(jù)，獲得黃芪的有效活性成分。

1.2活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)校正與轉(zhuǎn)化功能，將查詢到的黃芪活性成分轉(zhuǎn)換成靶蛋白的規(guī)范名稱。將活性成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件，處理黃芪的活性成分和靶點(diǎn)的相關(guān)信息，從而構(gòu)建出黃芪活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3EN相關(guān)靶點(diǎn)檢索

以“endometrial carcinoma”為關(guān)鍵詞，檢索Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)[6]、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)）[7]等疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)，匯總疾病靶點(diǎn)并去除重復(fù)值，得到EN相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.4蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

選用Cytoscape 3.7.0軟件中的Biogenet插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。分別將黃芪有效活性成分的靶點(diǎn)與EN的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Biogenet中，生成兩個(gè)獨(dú)立的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件中Merge功能對(duì)這兩個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)取交集，使用CytoNCA插件分析PPI交集網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性值。

1.5生物通路富集分析

應(yīng)用Metascape在線分析平臺(tái)[8]對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，解析黃芪中抗EN活性成分顯著影響的生物通路，并探討其發(fā)揮抗EN作用的可能機(jī)制。

2結(jié)果

2.1黃芪活性成分及靶點(diǎn)獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取到87個(gè)黃芪成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選得到17個(gè)成分。其具體信息見(jiàn)表1。

2.2黃芪活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將TCMSP查詢到的黃芪活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，得到黃芪活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。共獲得216個(gè)節(jié)點(diǎn)（包含198個(gè)靶點(diǎn)、17個(gè)活性成分和1個(gè)代表黃芪的節(jié)點(diǎn)）與427條關(guān)系，圖中節(jié)點(diǎn)面積大小代表相應(yīng)的Degree值，面積越大代表Degree值越大，表示與此點(diǎn)連接的邊越多，其重要性越高。

2.3EN疾病靶點(diǎn)

檢索Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到靶點(diǎn)個(gè)數(shù)為1 651個(gè)和196個(gè)。匯總靶點(diǎn)并去除重復(fù)靶點(diǎn)，最終收集到1 845個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.4黃芪治療EN的PPI網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4.1黃芪治療EN的PPI網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape 3.7.0構(gòu)建黃芪PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，可以與黃芪產(chǎn)生直接或間接作用的靶點(diǎn)為6 304個(gè)，6 304個(gè)靶點(diǎn)之間可產(chǎn)生的相互關(guān)系多達(dá)153 949種。同樣對(duì)EN的相關(guān)靶點(diǎn)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示有13 172個(gè)靶點(diǎn)與EN可產(chǎn)生直接或者間接的關(guān)系，其間的相互關(guān)系高達(dá)243 806種。用Cytoscape 3.7.0中的Merge功能對(duì)二者取交集，交集網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。

2.4.2黃芪治療EN的關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)黃芪治療EN的PPI交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，篩選出在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的靶點(diǎn)。黃芪治療EN關(guān)鍵靶點(diǎn)見(jiàn)圖3。經(jīng)過(guò)2次篩選后，共獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)238個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選策略見(jiàn)圖4。在得到核心PPI網(wǎng)絡(luò)后，應(yīng)用 MCODE插件對(duì)PPI模塊進(jìn)行分析，得到了MCODE1～7共7個(gè)模塊，見(jiàn)圖5。根據(jù)P值，分別保留每個(gè)模塊中2個(gè)評(píng)分最佳的生物學(xué)進(jìn)程以及描述功能，見(jiàn)表2。

2.5黃芪治療EN的通路富集分析

應(yīng)用Metascape平臺(tái)對(duì)上述238個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了基因富集分析， 包括GO的Biological Process（BP）、Cellular Component （CC）、Molecular Function（MF）以及KEGG通路。分析結(jié)果顯示，黃芪治療EN主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括端粒結(jié)構(gòu)（Telomere organization）、DNA修復(fù)（DNA repair）、DNA復(fù)制依賴性核小體裝配（DNA replication-dependent nucleosome assembly）、DNA復(fù)制依賴性核小體結(jié)構(gòu)（DNA replication-dependent nucleosome organization）、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝（Protein-DNA complex assembly）、rDNA染色質(zhì)沉默（chro-matin silencing at rDNA）和基因沉默調(diào)控（regula-tion of gene silencing）等。這些過(guò)程直接作用于細(xì)胞損傷的修復(fù)和凋亡環(huán)節(jié)，表明黃芪對(duì)于EN細(xì)胞的修復(fù)和凋亡具有直接的調(diào)控作用。KEGG通路富集結(jié)果涉及病毒性癌癥（Viral carcinogenesis）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、細(xì)胞周期（Cell cycle）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)（Transcriptional misregulation in cancer）、信號(hào)通路（Pathways in cancer）、MicroRNA（MicroRNAs in cancer）、HIF-1通路（HIF-1 signaling pathway）、Jak-STAT信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）、ErbB信號(hào)通路（ErbB signaling pathway）和蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）等。見(jiàn)圖6。

3討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探究了黃芪治療EN的活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)通路。根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，共篩選出黃芪活性成分17個(gè)，繪制上述活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖共獲得198個(gè)靶點(diǎn)和427條相互關(guān)系。由此可知，黃芪的有效成分之間存在協(xié)同作用，而協(xié)同調(diào)控的靶點(diǎn)也在EN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具有用于治療EN的潛力。

本文結(jié)果顯示，黃芪治療EN的主要成分可能為槲皮素、山奈酚、黃芪異黃烷苷等。其中，槲皮素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)胱硫氨酸γ-裂解酶（CTH）從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9];山奈酚可激活Caspase 9和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，同時(shí)也可以上調(diào)p38、p53、p21、p-BRCA1和p-ATM等抑癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]。

3.1關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果分析

本文研究按照篩選策略共得到238個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)Degree值排序，其中較為重要的靶點(diǎn)有NTRK1、TP53和CUL3等。有研究表明，NTRK1基因可編碼原肌球蛋白受體激酶（TRK）家族中的TRKA蛋白，TRKA蛋白與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素結(jié)合后，通過(guò)PI3K、Ras/MAPK/ERK和PLC-γ誘導(dǎo)受體二聚化、磷酸化和下游信號(hào)級(jí)聯(lián)激活。由于基因融合或核苷酸突變所導(dǎo)致的TRK通路異常，是許多癌癥發(fā)生發(fā)展的重要原因[12]。抑癌基因TP53可以轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)編碼FAS基因以及其他可能編碼相關(guān)死亡受體的基因，還可通過(guò)PUMA和NOXA介導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮顯著的腫瘤抑制功能[13]。CUL3屬于Cullin蛋白家族，可參與多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞分裂、分化、細(xì)胞骨架重塑、應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞功能等，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。提示黃芪可通過(guò)多靶點(diǎn)來(lái)影響EN發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

3.2通路與生物進(jìn)程分析

本文生物進(jìn)程富集分析結(jié)果顯示，黃芪治療EN涉及的生物學(xué)進(jìn)程包括端粒結(jié)構(gòu)、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制依賴性核小體裝配、DNA復(fù)制依賴性核小體組織、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝、rDNA染色質(zhì)沉默、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、基因沉默調(diào)控等。這些進(jìn)程與細(xì)胞修復(fù)和凋亡直接相關(guān)。這表明黃芪可能通過(guò)干擾EN細(xì)胞的修復(fù)和促進(jìn)其凋亡來(lái)發(fā)揮作用。

本文通路富集分析結(jié)果顯示，黃芪可干預(yù)病毒致癌、細(xì)胞周期、PI3K-Akt通路、MicroRNA、HIF-1通路、Jak-STAT信號(hào)通路、蛋白聚糖、ErbB通路等，調(diào)控EN病理過(guò)程中的不同環(huán)節(jié)。

綜上所述，黃芪治療EN的主要成分可能是槲皮素、山奈酚和黃芪異黃烷苷等，關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有NTRK1、TP53、CUL3等和涉及細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、癌癥通路等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。黃芪通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路的方式來(lái)干預(yù)EN的發(fā)生和發(fā)展，體現(xiàn)了中藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）