清解扶正顆粒通過(guò)PI3K/AKT通路抑制宮頸癌Caski細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)

劉 潔 ，彭 嬌 ，趙錦燕 ，2，3，林明和 ，林久茂 ，2，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

宮頸癌是一種多發(fā)于宮頸部位的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅全球女性健康和生命安全［1-3］。目前，研究表明宮頸癌與高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染相關(guān)，其中與HPV16型和 18 型的相關(guān)率達(dá) 70%［4-6］。已發(fā)現(xiàn) Caski 細(xì)胞包含高危型 HPV16 病毒［7］，因此，針對(duì) Caski 細(xì)胞的研究，對(duì)探討宮頸癌治療新途徑具有重要意義。清解扶正顆粒（Qingjie Fuzheng Granules，QFG）由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤科協(xié)定方（清解扶正方）改劑研制而成，組成為白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽，具有清熱解毒、扶正益氣的功效。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QFG 對(duì)Caski 細(xì)胞活力及生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，但QFG 對(duì)宮頸癌的作用及其可能機(jī)制至今尚未有報(bào)道。因此本研究通過(guò)建立人宮頸癌Caski 細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，探討QFG 對(duì)人宮頸癌Caski 細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物和配制方法 QFG 由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取QFG 粉末200 mg 于離心管內(nèi)，加1 mL 生理鹽水進(jìn)行溶解，配制濃度為200 mg/mL QFG 溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 4周齡SPF 級(jí)雄性BALB/c裸鼠12只，體質(zhì)量18～20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2014-0017，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001；宮頸癌Caski 細(xì)胞株購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)Life Technologies 公司）；細(xì)胞凋亡TUNEL 檢測(cè)試劑盒（中國(guó)凱基生物技術(shù)有限公司）；B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因相關(guān) X 蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life Technologies 公司；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica 公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和宮頸癌Caski 移植瘤模型建立 Caski 細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%FBS、1%雙抗（含100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素）的 DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液（密度為5.0×107個(gè)/mL），皮下接種于12只BALB/c 裸鼠右前肢腋窩處（200 μL/只）。接種4～5 d 后，當(dāng)裸鼠右側(cè)腋窩下生成綠豆大小移植瘤，即可判定模型建立成功。

1.4.2 動(dòng)物分組和給藥方法 待瘤體生長(zhǎng)至大于70～100 mm3后，根據(jù)瘤體體積的大小隨機(jī)將12只裸鼠分為對(duì)照組和QFG組，每組各6只，分組當(dāng)天立即給藥。QFG組：依據(jù)臨床等效劑量換算，按5 mL/（kg·d）灌服 200 mg/mL QFG 溶液。對(duì)照組：每只裸鼠灌服與QFG組等劑量的生理鹽水。2組裸鼠1周連續(xù)給藥 6 d，每天1次，共給藥6周。

1.4.3 檢測(cè)瘤體體積、體質(zhì)量 給藥期間每2 d 用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠瘤體的長(zhǎng)（L）及寬（W），計(jì)算瘤體體積；同時(shí)，用電子天秤稱量每只裸鼠的體質(zhì)量。瘤體體積計(jì)算公式：

瘤體體積＝π/6×L×W2

1.4.4 稱取瘤重、計(jì)算抑瘤率及采集相關(guān)標(biāo)本 停藥24 h 后對(duì)裸鼠脫頸處死，剝離瘤組織，觀察瘤體有無(wú)臟器轉(zhuǎn)移，稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率，并隨機(jī)選取3 個(gè)瘤體進(jìn)行拍照。將每個(gè)瘤體切分成2 份，1 份裝于1.5 mL 離心管內(nèi)暫放冰上，后續(xù)用于提取蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)；另1 份裝于含有4%多聚甲醛溶液的離心管內(nèi)進(jìn)行固定，后續(xù)用于TUNEL 染色。抑瘤率計(jì)算公式為：

抑瘤率＝［1－（治療組瘤重/對(duì)照組瘤重）］×100%

1.4.5 TUNEL 法檢測(cè)瘤體組織細(xì)胞凋亡 將剝離的腫瘤組織包埋、速凍后立即進(jìn)行冰凍切片（厚度4 μm），切片經(jīng)二甲苯、酒精脫蠟至水；用PBS 緩沖液沖洗（5 min×3次），再滴加1% Triton X-100 通透液于室溫下放置5 min；用TUNEL 免疫熒光試劑漂染腫瘤石蠟標(biāo)本切片，37℃避光孵育1 h，PBS 漂洗切片2次；加入DAPI 染料于避光的環(huán)境中室溫孵育15 min，PBS 漂洗3次；滴加適量抗熒光猝滅劑，蓋玻片封片，在避光的環(huán)境中將切片于電子熒光顯微鏡下觀察，其中熒光綠色為陽(yáng)性細(xì)胞，熒光藍(lán)色為區(qū)域總細(xì)胞，計(jì)算瘤體組織細(xì)胞凋亡率，凋亡率計(jì)算公式為：

凋亡率＝陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/區(qū)域總細(xì)胞數(shù)×100%

1.4.6 Western blot檢測(cè)瘤體組織蛋白表達(dá)水平 采用勻漿法對(duì)瘤體組織蛋白進(jìn)行提取，采用二喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測(cè)蛋白量。蛋白液體中加入適量上樣緩沖液在100℃金屬浴中進(jìn)行熱變性，完成蛋白制備；每份取50 μg 依次進(jìn)行蛋白樣品上樣，于聚丙烯酰胺凝膠中電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉對(duì)目的膜進(jìn)行封閉1 h；然后于含有0.25% Tween-20 的 TBST 中漂洗 15 min（5 min/次，共3次），最后孵育目的一抗（GAPDH、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、p-AKT；一抗稀釋比例為1/1 000）4℃搖床過(guò)夜。次日，孵育相對(duì)應(yīng)的二抗1 h（稀釋倍數(shù)1/5 000），最后滴加顯影液，Bio-Rad 成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行成像，用Image J 軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以Bax 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值、Bcl-2 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值分別得出Bax 和Bcl-2 相對(duì)蛋白表達(dá)量，以p-AKT 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值、AKT 蛋白灰度值/GAP?DH 蛋白灰度值分別得出p-AKT 和AKT 相對(duì)蛋白表達(dá)量，最后計(jì)算Bax/Bcl-2、p-AKT/AKT 比值：

Bax/Bcl-2＝Bax 相對(duì)蛋白表達(dá)量/Bcl-2 相對(duì)蛋白表達(dá)量

p-AKT/AKT＝p-AKT 相對(duì)蛋白表達(dá)量/AKT 相對(duì)蛋白表達(dá)量

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料服從正態(tài)分布以（）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 2組裸鼠體質(zhì)量比較 與對(duì)照組比較，QFG組裸鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 2組裸鼠體質(zhì)量比較

2.2 2組裸鼠瘤體體積比較 見(jiàn)圖2。對(duì)照組瘤體生長(zhǎng)快速，瘤體生長(zhǎng)曲線波動(dòng)幅度大；而QFG組裸鼠前3周瘤體體積與對(duì)照組并無(wú)明顯差異（P＞0.05），后3周瘤體體積波動(dòng)幅度小，與對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.05）。同時(shí)，從圖2B 也可看出QFG組瘤體體積，相較于對(duì)照組明顯減小。

圖2 2組裸鼠瘤體體積比較

2.3 2組裸鼠瘤重量及抑瘤率比較 見(jiàn)表1。

表1 2組裸鼠瘤重量、抑瘤率比較（）

表1 2組裸鼠瘤重量、抑瘤率比較（）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01。

抑瘤率/%0.00±0.00 79.72±0.151）組別對(duì)照組QFG組例數(shù)6 6瘤重量/g 0.59±0.12 0.12±0.041）

2.4 2組裸鼠瘤體組織細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)圖3。圖 3 顯示：對(duì)照組凋亡率為（5.24±0.57）%，QFG組凋亡率為（13.6±2.08）%，QFG組細(xì)胞凋亡率明顯增多（P＜0.05）。

圖3 2組裸鼠瘤體組織細(xì)胞凋亡情況比較（×200）

2.5 2組裸鼠瘤體組織Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比較 見(jiàn)圖4。圖4 顯示：與對(duì)照組比較，QFG組 Bax 蛋白表達(dá)水平增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，Bax/Bcl-2 明顯增高（P均＜0.05）。

圖4 2組裸鼠瘤體組織Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比較

2.6 2組裸鼠瘤體組織 PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表達(dá)水平及p-AKT/AKT 比較 見(jiàn)圖5。圖5 顯示：與對(duì)照組比較，QFG組PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P均＜0.05），AKT 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差別（P＞0.05），但p-AKT/AKT 降低（P＜0.05）。

圖5 2組裸鼠瘤體組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平及p-AKT/AKT 比較

3 討 論

宮頸癌屬中醫(yī)“崩漏”“瘕聚”范疇。主要由臟腑氣血失調(diào)，濕毒侵積于下，沖任二脈受損而成。治療本病以扶正祛邪、消疒征散結(jié)為原則。中藥復(fù)方QFG組方中白花蛇舌草、半枝蓮對(duì)宮頸癌等多種惡性腫瘤具有良好的抑制作用［8-11］，可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路參與宮頸癌細(xì)胞凋亡［12］；炙黃芪、炒麥芽益氣健脾，可緩解患者長(zhǎng)期放化療產(chǎn)生的毒副作用，提高宮頸癌患者自身免疫力［13］。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)QFG 可抑制宮頸癌Caski 細(xì)胞活力及生長(zhǎng)，但QFG 對(duì)宮頸癌的作用及其機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示：QFG 對(duì)人宮頸癌Caski 細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，包括降低瘤體體積、瘤重和增加抑瘤率；同時(shí)，QFG 可增加瘤體組織中細(xì)胞凋亡率。由此可見(jiàn)QFG 可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)宮頸癌Caski 細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是由基因主動(dòng)決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程［14］。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2 家族扮演重要角色，其通過(guò)控制線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)凋亡激活物如細(xì)胞色素C 的釋放，從而影響細(xì)胞的凋亡。Bax 二聚體可以打開(kāi)線粒體膜，增加膜通透性；Bcl-2 可以與Bax 形成異聚體，Bcl-2 增加，線粒體膜通透性隨之降低；Bax/Bcl-2增加可說(shuō)明細(xì)胞凋亡增加［15］。本研究結(jié)果也表明QFG 增加Bax/Bcl-2，說(shuō)明QFG 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［16］。已有報(bào)道，PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡具有直接或間接的調(diào)控作用［17］。直接調(diào)控作用表現(xiàn)在活化的AKT 會(huì)抑制BAD 磷酸化、促進(jìn)Bax 的Ser184 位點(diǎn)磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡；間接調(diào)控作用表現(xiàn)在活化的AKT 與MDM2 結(jié)合，促使MDM2 的 Ser166 和 Ser186 位點(diǎn)磷酸化，核內(nèi)泛素連接酶活性上調(diào)，導(dǎo)致p53 失活，阻斷了p53 促凋亡作用［18］。本研究結(jié)果顯示：經(jīng) QFG 治療后，PI3K 蛋白表達(dá)及p-AKT/AKT 均下調(diào)，說(shuō)明QFG 可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通絡(luò)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，QFG 可顯著抑制裸鼠宮頸癌Caski細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)瘤體組織細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 通路活化，促進(jìn)Bax/Bcl-2 升高有關(guān)。