全自動(dòng)固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定釀造用水中的20種農(nóng)藥殘留

黃 箭，謝正敏，安明哲，魏金萍，張 倩，薛潤(rùn)萍

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，是生產(chǎn)和使用農(nóng)藥最多的國(guó)家。隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)中，常見(jiàn)的農(nóng)藥種類包括有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯類以及氨基甲酸酯類等，其作用是消滅、控制或預(yù)防危及農(nóng)業(yè)的病、蟲(chóng)害、雜草等有害物質(zhì)。我國(guó)每年使用農(nóng)藥高達(dá)上百種，使用量高達(dá)百余萬(wàn)噸，但只有30 %左右的農(nóng)藥能夠被利用，大量未被利用的農(nóng)藥通過(guò)降雨、地表徑流等方式進(jìn)入水環(huán)境污染水源，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)潛在的危害。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，水環(huán)境中主要農(nóng)藥污染物為有機(jī)氯農(nóng)藥（organochlorine pesticides，OCPs）和有機(jī)磷農(nóng)藥（organophosphorus pesticides，OPPs）。Pan 等調(diào)查發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江流域中間段地下水中農(nóng)藥含量OCPs 含量最高；Gao 等對(duì)我國(guó)淡水流域地表水中農(nóng)藥殘留調(diào)查發(fā)現(xiàn)OPPs 含量高于OCPs。研究表明，水環(huán)境中主要OCPs 是六六六（hexachlorocyclohexane，HCH）和滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）。農(nóng)業(yè)部自頒布《到2020 年農(nóng)藥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)方案》后，OPPs 的施用量雖有所下降，但是敵敵畏、毒死蜱和馬拉硫磷等OPPs 每年的使用量仍達(dá)到1000～30000 t，導(dǎo)致水環(huán)境中不斷有OPPs檢出。

古人云“水乃酒之魂”，水是酒的主要成分之一，不管是利用傳統(tǒng)技術(shù)釀酒還是現(xiàn)代新工藝技術(shù)釀酒，水質(zhì)決定了酒質(zhì)，水質(zhì)的好壞直接影響著酒的質(zhì)量。所謂名酒產(chǎn)地，必有佳泉，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為只有潔凈的泉水才能釀出醇香的美酒，許多名優(yōu)酒廠均選建在有良好水源的地方。釀造用水中所含的各種成分，都與微生物的生長(zhǎng)、酶的形成、糟醅的發(fā)酵以及成品酒的質(zhì)量息息相關(guān)。水中的農(nóng)藥殘留會(huì)對(duì)白酒的食品安全造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)，因此建立釀造用水中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法有很多，主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）。水環(huán)境中農(nóng)藥殘留檢測(cè)最常用的前處理方法有液液萃?。╨iquid liquid extraction，LLE）和固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）。液液萃取通常需要使用大量的有機(jī)溶劑，且對(duì)環(huán)境污染較大，樣品的重現(xiàn)性較差；固相萃取可以將農(nóng)藥的萃取、濃縮、選樣等多種功能技術(shù)匯集于一體，從而大幅度地優(yōu)化和提升萃取工作效率，同時(shí)溶劑使用量少，有利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。由于水中農(nóng)殘的含量較低，通常選用固相萃取來(lái)對(duì)水中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行富集、濃縮來(lái)提高目標(biāo)物的檢出限。實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)固相萃取方式進(jìn)行前處理，并進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)釀造用水中20 種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：敵敵畏、α-六六六、樂(lè)果、呋喃丹、β-六六六、γ-六六六、五氯硝基苯、δ-六六六、甲基對(duì)硫磷、七氯、馬拉硫磷、艾氏劑、毒死蜱、對(duì)硫磷、狄氏劑、P,P'-滴滴涕（P,P'-DDT）、異狄氏劑、O,P'-滴滴涕（O,P'-DDT）、P,P'-滴滴伊（P,P'-DDE）、P,P'-滴滴滴（P,P'-DDD），質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司。

試劑：乙酸乙酯（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；二氯甲烷（色譜純），西隴化工股份有限公司；正己烷（色譜純），甲醇（色譜純），德國(guó)Merck 公司；CNWBOND LC-C柱（500 mg/6 mL），Poly-Sery HLB Pro 柱（200 mg/6 mL），上海安譜實(shí)驗(yàn)有限公司；無(wú)水硫酸鈉，成都科隆化學(xué)品有限公司。

儀器設(shè)備：7890B-7000C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；Fotector plus60 全自動(dòng)固相萃取儀，AUTO EVA60 全自動(dòng)濃縮儀，?？苾x器有限公司；milli-Q純水機(jī),密理博有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)殘混合標(biāo)液的配制

準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的有機(jī)磷、呋喃丹、狄氏劑、異狄氏劑各200 μL，其余農(nóng)藥各100 μL于10 mL的棕色容量瓶中，加入乙酸乙酯定容，混勻后得部分農(nóng)殘質(zhì)量濃度為2 μg/mL，其余為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液的配制：采用逐級(jí)稀釋法配制不同濃度的農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白基質(zhì)將農(nóng)殘混標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋成1 μg/L、3 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為氦氣（純度≥99.999 %），流速1 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：起始溫度60 ℃，保持1 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，保持0.5 min，以2 ℃/min 升至190 ℃，1 ℃/min 升至195 ℃，再以5 ℃/min 升至230 ℃，最后以20 ℃/min 升至280 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；輔助加熱溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件：采用EI多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），溶劑延遲：5 min，離子源溫度：230 ℃，四級(jí)桿1 溫度：150 ℃，四級(jí)桿2溫度：150 ℃，碰撞氣為高純氮?dú)狻?/p>

1.2.3 水樣前處理

體育旅游以其較強(qiáng)的參與性、靈活性和娛樂(lè)性等特點(diǎn)，延伸出紛繁多彩的新形式。而傳統(tǒng)的觀光旅游也正在逐步向體驗(yàn)式旅游轉(zhuǎn)變[1]，體育賽事活動(dòng)、體育場(chǎng)（館）服務(wù)業(yè)、體育健身休閑以及體育用品制造等與旅游產(chǎn)業(yè)相結(jié)合，形成“賽事型體育旅游”“運(yùn)動(dòng)休閑型體育旅游”等特定形式的體育旅游地。當(dāng)前，我國(guó)體育特色小鎮(zhèn)正以“體育+旅游”的主要模式蓬勃發(fā)展。

將取回的水樣置于棕色玻璃瓶中，按照水樣∶甲醇=100∶1 的比例在水中加入甲醇作為穩(wěn)定劑。待測(cè)水樣用0.25 μm 濾膜過(guò)濾，置于4 ℃冰箱中保存，于7 d 內(nèi)進(jìn)行萃取。取經(jīng)過(guò)濾后的水樣500 mL以10 mL/min的速度通過(guò)HLB萃取柱。水樣萃取完成后，用氮?dú)獯蹈蒘PE小柱，用10 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1）分兩次淋洗（詳情見(jiàn)表1），再用5 mL 乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1）潤(rùn)洗樣品瓶，合并洗脫液，用無(wú)水硫酸鈉除水后氮吹至近干，用混合液定容至1 mL，待儀器測(cè)定。

表1 全自動(dòng)固相萃取流程

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于化合物的種類較多，各化合物對(duì)質(zhì)譜的響應(yīng)差別較大，根據(jù)目標(biāo)農(nóng)殘?jiān)谫|(zhì)譜上響應(yīng)的差異，首先配制高濃度的農(nóng)殘混合標(biāo)樣進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，確定各物質(zhì)的保留時(shí)間后，逐個(gè)分析其質(zhì)譜圖，比較每一種化合物產(chǎn)生的碎片離子的相對(duì)豐度，選擇豐度較高、干擾較小的離子作為母離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化對(duì)應(yīng)的電離能，在不同的電離情況下確定各個(gè)化合物響應(yīng)最佳的碎片離子，選擇響應(yīng)較好的兩個(gè)子離子作為定量離子和輔助定性離子，通過(guò)以上方法確定20 種目標(biāo)農(nóng)殘的MRM 離子對(duì)信息，見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)為使各農(nóng)殘?jiān)谫|(zhì)譜上響應(yīng)強(qiáng)度相近，配制了不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，由此獲得的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，圖1 有機(jī)磷、呋喃丹、艾氏劑、狄氏劑配置為20 μg/L，其余農(nóng)藥為10 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

圖1 20種農(nóng)藥標(biāo)樣的MRM圖

表2 20種農(nóng)藥的保留時(shí)間及離子對(duì)參數(shù)

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱的萃取效率對(duì)樣品的檢測(cè)極為重要，決定萃取效果的是SPE 小柱填充劑的類型、上樣速度以及洗脫溶劑的種類及流速，本研究所需富集的目標(biāo)農(nóng)殘主要為有機(jī)氯和有機(jī)磷兩類，有機(jī)氯基本都是非極性化合物，有機(jī)磷多為中等級(jí)性化合物，根據(jù)目標(biāo)農(nóng)殘的類型，方法選用C柱和HLB柱，均為反相柱，適用于非極性至中等極性的化合物的富集。由圖2 可知，C柱對(duì)20 種農(nóng)殘的回收率范圍為29.4 %～114.11 %，平均回收率為93.81 %；HLB 小柱對(duì)20 種農(nóng)殘的回收率范圍為55.91 %～102.31 %，平均回收率為87.64 %。其中樂(lè)果回收率HLB 柱可達(dá)95.51 %，C柱為29.4 %，這與有關(guān)研究的C對(duì)水中樂(lè)果的回收率高達(dá)80%以上不符，艾氏劑的回收率只有60%左右，其他回收率均在70%～110%之間，且兩根小柱的回收率相差不大。為保證多數(shù)農(nóng)殘的回收率，選擇HLB小柱為萃取小柱。

圖2 不同小柱對(duì)目標(biāo)農(nóng)殘的回收率比較

2.2.2 洗脫液的選擇

圖3 不同混合溶劑對(duì)目標(biāo)農(nóng)殘洗脫效率的影響

2.2.3 水樣pH值的選擇

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有機(jī)磷農(nóng)藥在中性或酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下易發(fā)生降解，研究將水樣pH 值用鹽酸調(diào)節(jié)至2～3，同時(shí)對(duì)照組不調(diào)節(jié)pH值，采用全自動(dòng)固相萃取儀對(duì)水樣進(jìn)行富集，經(jīng)洗脫、濃縮后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，水樣pH 值對(duì)目標(biāo)農(nóng)殘的回收率影響較小，將水樣pH 值調(diào)至酸性對(duì)回收率并沒(méi)有較大的改善作用。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)對(duì)目標(biāo)組分的信號(hào)產(chǎn)生增強(qiáng)或者抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)（ME=B/A，A 為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值，B 為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥的響應(yīng)值）比值在0.9 和1.1 之間，表示基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，大于1.2 為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，小于0.9 為基質(zhì)效應(yīng)減弱。研究用經(jīng)mili-Q 處理過(guò)的超純水進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)部分農(nóng)殘回收率的影響較大，均為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，分別計(jì)算了用基質(zhì)配標(biāo)和溶劑配標(biāo)的回收率，見(jiàn)圖4—圖5。結(jié)果表明，若用溶劑配標(biāo)去計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果普遍高于100 %，其中樂(lè)果、呋喃丹、馬拉硫磷、異狄氏劑的回收率均大于120%，呋喃丹回收率達(dá)200%以上，馬拉硫磷回收率高達(dá)180%，其他農(nóng)殘的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，而用基質(zhì)配標(biāo)回收率均在70 %～110 %之間。趙麗在對(duì)生活飲用水中14種農(nóng)藥殘留檢測(cè)中用C8、PEP柱進(jìn)行加標(biāo)回收時(shí)部分農(nóng)殘回收率高達(dá)300%，這是忽略了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)農(nóng)藥的影響，因此用基質(zhì)配標(biāo)進(jìn)行加標(biāo)回收的計(jì)算更為準(zhǔn)確。

圖4 溶劑配標(biāo)和基質(zhì)配標(biāo)的色譜對(duì)比圖

圖5 基質(zhì)配標(biāo)和溶劑配標(biāo)對(duì)加標(biāo)樣回收率的影響

2.5 回歸方程、線性范圍和檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按上述條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，分別以每種標(biāo)樣的濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在1～200 μg/L 范圍內(nèi)20 種農(nóng)藥線性良好，相關(guān)系數(shù)R≥0.993。方法的檢出限（limit of detection，LOD）以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以S/N=10計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 20種農(nóng)殘的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

2.6 加標(biāo)回收率

在500 mL 空白水樣中加入目標(biāo)農(nóng)殘，添加濃度分別為50 ng/L、100 ng/L、200 ng/L，每個(gè)濃度水平平行6 次，按優(yōu)化條件處理并分析水樣，回收率及精密度見(jiàn)表4。除七氯和艾氏劑外，其他18 種農(nóng)殘平均回收率在81.57 %～115.91 %之間，RSD 在4%～13%之間，均在允許偏差內(nèi)。

表4 不同加標(biāo)水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%，n=6)

2.7 樣品檢測(cè)

采用優(yōu)化后的參數(shù)對(duì)車間釀酒用水進(jìn)行農(nóng)殘檢測(cè)，除敵敵畏、α-六六六、呋喃丹、γ-六六六、δ-六六六、對(duì)硫磷以外，其余農(nóng)殘均有檢出，含量為0.003～0.021 μg/L，均低于國(guó)標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)全自動(dòng)固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，建立了釀造用水中20 種常見(jiàn)農(nóng)殘檢測(cè)方法。在擬定的實(shí)驗(yàn)條件下，20種農(nóng)藥得到了較好的分離，除艾氏劑、七氯外，其他農(nóng)殘的方法檢測(cè)限、回收率和靈敏度均滿足痕量農(nóng)殘分析技術(shù)要求。實(shí)驗(yàn)表明，艾氏劑和七氯用C小柱的回收率比HLB小柱富集的回收率高，其他農(nóng)殘的回收率均不及HLB 小柱，綜合其他農(nóng)殘的回收率選擇了HLB小柱，這可能是其回收率偏低的原因。該法相比于傳統(tǒng)的液液萃取，能有效富集水中的有機(jī)物，克服了傳統(tǒng)液液萃取中試劑用量大、污染環(huán)境、回收率不高等缺點(diǎn)，同時(shí)節(jié)約了人工，能完全實(shí)現(xiàn)樣品預(yù)處理的自動(dòng)化操作。