兒童肝移植免疫耐受的研究進(jìn)展

周艾煒 劉源 薛峰 夏強(qiáng)

自1963年Starzl團(tuán)隊(duì)成功實(shí)施第一例人體肝移植手術(shù)以來，隨著外科技術(shù)、移植物保存及圍手術(shù)期管理水平的提高，肝移植已成為兒童終末期肝病最有效的治療方式，術(shù)后1年和5年受者生存率分別達(dá)到91.1%和86.3%[1]。移植物功能的長(zhǎng)期穩(wěn)定對(duì)于受者的預(yù)后和生存質(zhì)量至關(guān)重要，也是器官移植領(lǐng)域面臨的共同挑戰(zhàn)，當(dāng)前的共識(shí)是通過終身服用免疫抑制劑[如糖皮質(zhì)激素（激素）、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑等]減少受者免疫系統(tǒng)對(duì)移植物的攻擊，預(yù)防排斥反應(yīng)，但長(zhǎng)期服用免疫抑制劑可能導(dǎo)致感染、骨髓抑制、腎功能異常、腫瘤等不良反應(yīng)[2-5]。北歐一項(xiàng)基于人群的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究顯示，兒童肝移植受者在長(zhǎng)期隨訪中發(fā)生腫瘤的可能性會(huì)增加10倍[6]。免疫抑制劑的長(zhǎng)期不良反應(yīng)不僅影響全身器官功能和生長(zhǎng)發(fā)育，也極大影響了兒童肝移植受者的總體生活質(zhì)量，一定程度上阻礙了其在未來與社會(huì)的融入，加重其整個(gè)成長(zhǎng)階段的心理負(fù)擔(dān)[7-8]。特別是在青春期，心理和生理的快速改變使得兒童肝移植受者的服藥依從性大大降低，因隨意停藥或亂用藥物導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥成為了該階段肝功能波動(dòng)的最主要因素[9-10]。

因此，對(duì)免疫耐受的臨床研究成為了減少免疫抑制劑用量的關(guān)鍵[11-12]。免疫耐受狀態(tài)下，雖然機(jī)體對(duì)供者來源性抗原不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但仍能清除其它外源性抗原，這也被稱為供肝特異性免疫沉默[13]。臨床上部分受者在不服用免疫抑制劑的情況下，移植物能維持正常功能，且組織學(xué)上沒有排斥反應(yīng)跡象，即達(dá)到免疫耐受狀態(tài)[14]。相比其它類型的移植物，肝臟作為免疫豁免器官，具有更豐富的內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)性，有助于自發(fā)性耐受形成[15-16]。在肝移植早期受者中已有報(bào)道，部分受者由于主動(dòng)或被動(dòng)因素減少免疫抑制劑服藥量，甚至在完全停藥狀態(tài)下，依然能保持穩(wěn)定的肝功能[17-18]。

1 兒童受者免疫耐受的特點(diǎn)

兒童肝移植的主要原發(fā)病是膽道閉鎖，占所有肝移植患兒的75%[19]。這類患兒通常需要在2歲內(nèi)接受肝移植治療[20-21]。與成人肝移植受者不同，兒童肝移植在中國(guó)主要的手術(shù)方式是親屬活體肝移植，即將患兒直系親屬捐獻(xiàn)的部分肝臟移植入患兒體內(nèi)[22-23]。低齡患兒自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，加之親屬肝移植組織相容性的優(yōu)勢(shì)，使得低齡肝移植患兒機(jī)體對(duì)移植物具有更好的耐受性。在部分肝移植患兒中減量或者停用免疫抑制劑不僅能夠極大地減緩長(zhǎng)期服用免疫抑制劑的不良反應(yīng)，也能夠提高患兒服藥的依從性。此外，兒童肝移植受者乙型病毒性肝炎（乙肝）、丙型病毒性肝炎（丙肝）等感染性疾病的發(fā)生率遠(yuǎn)低于成人，肝臟病理和肝內(nèi)免疫環(huán)境受外源因素干擾小，對(duì)于免疫耐受的評(píng)估和分子機(jī)制研究更有利。

2 免疫耐受的誘導(dǎo)

兒童肝移植受者實(shí)現(xiàn)免疫耐受主要有3種方式，即被動(dòng)免疫耐受、主動(dòng)操作性免疫耐受和誘導(dǎo)性免疫耐受。被動(dòng)免疫耐受主要是患兒因感染、嚴(yán)重免疫抑制劑相關(guān)不良反應(yīng)等原因被迫停用免疫抑制劑，部分患兒在長(zhǎng)期停用免疫抑制劑后肝功能仍維持穩(wěn)定，無明顯肝內(nèi)炎癥和排斥反應(yīng)的表現(xiàn)，達(dá)到免疫耐受狀態(tài)。主動(dòng)操作性免疫耐受是在長(zhǎng)期隨訪肝功能穩(wěn)定且服藥量較低的患兒中主動(dòng)程序性撤除免疫抑制劑，在逐步撤藥的過程中篩選出可以達(dá)到免疫耐受狀態(tài)的患兒。這種方法適用于術(shù)后時(shí)間較長(zhǎng)、單藥免疫抑制劑維持且依從性較好的患兒，并在有經(jīng)驗(yàn)的肝移植中心進(jìn)行。對(duì)于在主動(dòng)撤藥期間發(fā)生排斥反應(yīng)的患兒需及時(shí)恢復(fù)免疫抑制劑用量，必要時(shí)需通過激素治療。誘導(dǎo)性免疫耐受主要是通過輸注干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等誘導(dǎo)肝移植患兒對(duì)移植物的耐受反應(yīng)，從而達(dá)到誘導(dǎo)免疫耐受的目的。

3 操作性免疫耐受

對(duì)兒童肝移植術(shù)后操作性免疫耐受的臨床研究包括單中心及多中心的研究，其中美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校（University of California at San Francisco，UCSF）移植中心Sandy Feng教授開展了目前最為全面和規(guī)模最大的多中心研究。在其2006年至2009年進(jìn)行的WISP-R研究中，入組了20例兒童肝移植受者，其中12例實(shí)現(xiàn)完全免疫耐受，比例高達(dá)60%，且患兒在隨訪期間肝功能穩(wěn)定，未見肝內(nèi)炎癥和纖維化改變[24-25]。同時(shí)，免疫耐受患兒體內(nèi)供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）水平未見明顯提高。對(duì)于撤藥期間發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患兒，加用免疫抑制劑均使肝功能恢復(fù)正常，且在長(zhǎng)期隨訪中未見肝內(nèi)炎癥和纖維化發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)eng等[26]在2012年至2014年再次對(duì)88例肝移植患兒進(jìn)行操作性免疫耐受的安全性評(píng)價(jià)（iWITH），結(jié)果顯示37.5%達(dá)到免疫耐受，18.0%停藥后肝穿刺病理檢查提示排斥反應(yīng)可能，再次加用免疫抑制劑，隨訪期間免疫耐受和非免疫耐受患兒肝功能、肝內(nèi)炎癥、肝內(nèi)纖維化、DSA等未見明顯異常，證明了在經(jīng)過篩選的患兒中操作性免疫耐受的安全性和有效性。同時(shí)，在未達(dá)到免疫耐受的患兒中，超過一半患兒的免疫抑制劑用量明顯低于初始劑量，表明在肝移植患兒中進(jìn)行操作性免疫耐受對(duì)降低長(zhǎng)期免疫抑制劑暴露量也有著重要意義。

兒童肝移植術(shù)后長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn)肝纖維化和炎癥反應(yīng)發(fā)生率隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷提高，術(shù)后1、5、10年肝纖維化的發(fā)生率分別達(dá)到52%、81%、91%，而纖維化的發(fā)生與供肝冷缺血時(shí)間、供受者年齡等密切相關(guān)。在移植術(shù)后因各種原因停用免疫抑制劑的肝移植患兒中，程序性肝穿刺以明確肝內(nèi)病理變化，特別是纖維化的程度尤為重要。Yoshitomi等[27]研究發(fā)現(xiàn)，雖然免疫耐受患兒在隨訪期間肝功能始終維持穩(wěn)定，肝內(nèi)未見明顯排斥反應(yīng)，但耐受患兒肝內(nèi)纖維化的總體程度仍高于正常服用免疫抑制劑的患兒。同時(shí)，在纖維化較嚴(yán)重的患兒中重新加用免疫抑制劑能夠緩解肝內(nèi)纖維化程度，提示免疫耐受后肝內(nèi)的輕度炎癥反應(yīng)或抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)可能與纖維化的發(fā)展有關(guān)。在Feng等[24]后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過嚴(yán)格篩選且按照一定程序進(jìn)行操作性免疫耐受的肝移植患兒，在5年的隨訪中肝內(nèi)纖維化程度無明顯增加。這些研究說明，在免疫耐受患兒中定期進(jìn)行肝臟病理穿刺并評(píng)估肝內(nèi)炎癥和纖維化程度對(duì)維持患兒肝臟長(zhǎng)期功能具有非常重要的意義。

4 誘導(dǎo)性免疫耐受

與主動(dòng)操作性免疫耐受主要在肝移植術(shù)后長(zhǎng)期隨訪患兒中開展不同，誘導(dǎo)性免疫耐受通過在移植術(shù)后輸注干細(xì)胞或者具有調(diào)節(jié)功能的免疫細(xì)胞，幫助肝移植受者在術(shù)后早期實(shí)現(xiàn)免疫耐受[28-29]。常用的誘導(dǎo)性免疫細(xì)胞包括Treg、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）、調(diào)節(jié)性DC（regulatory DC，DCreg）等，目前大部分的臨床研究主要是Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗(yàn)[30]。Todo等[31]在進(jìn)行過脾切除的活體肝移植受者中輸注Treg，術(shù)后18個(gè)月有70%達(dá)到免疫耐受狀態(tài)，且在2年的隨訪中肝功能維持穩(wěn)定，這是目前細(xì)胞誘導(dǎo)性免疫耐受在肝移植受者中最成功的臨床研究。MSC可以通過抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞的活化以及促進(jìn)Treg的增殖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，在多項(xiàng)腎移植術(shù)后誘導(dǎo)性免疫耐受臨床研究中都獲得了良好結(jié)果[32]。然而，針對(duì)MSC誘導(dǎo)肝移植術(shù)后免疫耐受的臨床研究雖然證明了外源性MSC輸注的安全性，且能一定程度緩解缺血-再灌注和急性排斥反應(yīng)引起的肝損傷，但是對(duì)免疫耐受的誘導(dǎo)效果仍不確定，多數(shù)肝移植受者仍無法達(dá)到理想的免疫耐受狀態(tài)[33-34]。美國(guó)匹茲堡大學(xué)Thomson等[35]通過供者來源的DCreg誘導(dǎo)活體肝移植受者免疫耐受的臨床實(shí)驗(yàn)初步證明了DCreg輸注的安全性和可行性，但對(duì)免疫功能的長(zhǎng)期調(diào)節(jié)作用仍需進(jìn)一步觀察。此外，包括造血干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞和骨髓來源的免疫細(xì)胞誘導(dǎo)肝移植術(shù)后免疫耐受的研究也在陸續(xù)開展中[36-39]，然而，細(xì)胞誘導(dǎo)性免疫耐受仍存在包括細(xì)胞產(chǎn)品制備的安全性、細(xì)胞輸注流程的規(guī)范化、免疫抑制劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)品功能的影響、潛在的移植物抗宿主病風(fēng)險(xiǎn)、缺乏多中心大樣本的有效性驗(yàn)證等問題，未來仍需移植科醫(yī)師及科研人員繼續(xù)探索[40]。操作性免疫耐受與誘導(dǎo)性免疫耐受臨床試驗(yàn)進(jìn)展見表1[25-26,31,41-63]。

表1 操作性免疫耐受與誘導(dǎo)性免疫耐受臨床試驗(yàn)進(jìn)展Table 1 Progress in clinical trials of operational immune tolerance and induced immune tolerance

續(xù)表1

5 受者篩選與耐受標(biāo)志物

如何篩選實(shí)現(xiàn)免疫耐受的肝移植患兒也是不少肝移植中心的研究重點(diǎn)[64-66]。由于缺乏足夠的大樣本前瞻性臨床研究，對(duì)免疫耐受患兒的群體特征通常通過回顧性研究進(jìn)行分析，相關(guān)指標(biāo)缺乏足夠的臨床驗(yàn)證。Martínez-Llordella等[67]發(fā)現(xiàn)，免疫耐受患兒外周血中RAD21、RAD50、RBBP9、APRIN等調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖的基因和γ σT細(xì)胞與自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞表面受體的基因表達(dá)明顯增多，且外周血內(nèi)CD4+CD25+細(xì)胞與γ σT細(xì)胞的比例升高，提示調(diào)節(jié)性細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。Lau等[68]通過對(duì)外周血進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CD4+CD5+CD25+CD38-/lowCD45RA-細(xì)胞在免疫耐受患兒中比例明顯增高，可考慮作為篩選免疫耐受群體的標(biāo)志之一。Li等[69]也發(fā)現(xiàn)免疫耐受患兒外周血存在更高比例的CD4+CD25+Treg和Vδ1/Vδ2 γ σ T細(xì)胞。Bohne等[70]分析移植肝內(nèi)轉(zhuǎn)錄組學(xué)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)與鐵代謝相關(guān)的基因（CDHR2、MIF、PEBP1、SOCS1、TFRC）能夠?qū)γ庖吣褪芑颊哌M(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，其靈敏度和特異度分別為0.89和0.86，但是目前鐵代謝影響免疫耐受的機(jī)制仍不清楚。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，在經(jīng)過篩選的兒童肝移植受者中實(shí)現(xiàn)免疫耐受不僅安全有效，還能極大降低免疫抑制劑的總體暴露量，減少免疫抑制劑相關(guān)不良反應(yīng)，提高患兒長(zhǎng)期隨訪的依從性和積極性。然而，通過細(xì)胞療法在肝移植術(shù)后早期誘導(dǎo)免疫耐受雖然安全，但其誘導(dǎo)效果仍需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。目前，對(duì)于耐受相關(guān)生物標(biāo)志物的研究主要是回顧性研究，盡管能揭示免疫耐受群體外周血的免疫系統(tǒng)特征，但個(gè)體差異相對(duì)較大且無法做到良好的預(yù)測(cè)作用，而前瞻性研究及肝內(nèi)免疫狀態(tài)的研究相對(duì)缺乏，因此對(duì)免疫耐受群體的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)的相關(guān)研究仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。