二巰基乙醇解決CD38單克隆抗體對輸血前檢測的干擾及療效分析*

袁 燕，鄧超干，蔡欽泉，羅欽泉

深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院輸血科，廣東深圳 518001

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細胞異常增殖的惡性疾病，在很多國家是血液系統(tǒng)第2 位常見惡性腫瘤，僅次于淋巴瘤[1]。隨著新藥出現(xiàn)及檢測手段的提高，多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療不斷改進和完善。 2019年7月，中國國家藥品監(jiān)督管理局批準達雷妥尤單抗(DARA)上市，該藥是人源化抗CD38IgG1κ單克隆抗體,可以通過多種免疫介導的作用機制誘導腫瘤細胞的快速死亡。文獻[2]增加了達雷妥尤單抗聯(lián)合治療部分及相關注意事項，隨著指南的修訂，DARA已經(jīng)成為了一種高效的治療多發(fā)性骨髓瘤的一線藥物。CD38是一種完整的跨膜糖蛋白，在紅細胞表面也有不同程度的表達[3-5]。它具有多種功能，包括酶活性、細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)和受體介導的黏附。DARA的抗骨髓瘤活性通過CD38單克隆抗體(簡稱CD38單抗)介導的免疫機制發(fā)生，包括補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬作用和免疫抑制調(diào)節(jié)性T細胞的免疫調(diào)節(jié)性耗竭，通過CD38直接的表面信號傳導途徑，發(fā)生腫瘤細胞凋亡[6]。CD38單抗免疫機制會干擾輸血相容性檢測，導致抗體篩查陽性和交叉配血不合。本文通過回顧2例使用DARA治療的多發(fā)性骨髓瘤患者接受32次輸血治療，總結(jié)分析0.2 mol/L二巰基乙醇(2-Me)對輸血相容性檢測的處理及輸血實踐的影響。

1 資料與方法

1.1研究對象 病例1：男性患者，64歲，2016年確診多發(fā)性骨髓瘤，先后行硼替佐米/地塞米松(VD)方案、硼替佐米/阿霉素/地塞米松(PAD)方案治療后，病情好轉(zhuǎn)，期間曾有輸血治療。2020年2月病例1患者因多發(fā)性骨髓瘤再次入院，2020年2-4月其在本院行DARA+PAD治療，由于病例1患者貧血因此給予其輸血治療。病例2：女性患者，62歲，既往無重大病史，孕2產(chǎn)2，無輸血史，2020年6月發(fā)現(xiàn)腎功能不全入院，診斷為多發(fā)性骨髓瘤。病例2患者一直在本院進行規(guī)律化療和其他對癥治療，2020年6月20日至2021年6月行DARA+PAD方案治療，由于病例2患者貧血因此給予其輸血治療。病例1和病例2患者輸注的血液來自無償獻血者，由深圳市血液中心分離制備為去白細胞懸浮紅細胞。

1.2對照 陰性對照為未使用CD38單抗治療且無不規(guī)則抗體的血漿標本；陽性對照為未使用CD38單抗治療但不規(guī)則抗體陽性，經(jīng)鑒定3份標本中分別含抗E、抗JKa、抗M抗體。采用0.2 mol/L的2-Me 處理抗篩細胞前后進行抗體篩查實驗，驗證2-Me消除CD38單抗干擾對意外抗體檢測的影響。

1.3儀器與試劑 戴安娜全自動血型配血儀(型號：WADiana Compact)；久保田離心機(型號：KA-2200)；電熱恒溫水槽(型號：CU-600型)；正反定型血型卡(西班牙 Diagnostic Grifols，批號:18009.01、20012.01)；抗人球蛋白卡(西班牙 Diagnostic Grifols，批號19116.01、19189.01、20122.01)；ABO血型反定型細胞(上海血液生物，批號：20205304、20205308、20205335)；抗體篩查細胞(上海血液生物，批號：20207043、20217005)；十二系抗體鑒定細胞(上海血液生物，批號:20200226、20200611、20201113)；凝聚胺試劑(珠海貝索，批號：A191001、A191101、A200802)； 0.2 mol/L 2-Me(上海血液生物，批號：20191201、20200302、20201901)。

1.4處理紅細胞 用移液器吸取待滅活紅細胞(獻血者紅細胞、抗篩細胞)，用生理鹽水懸浮，1 000×g離心1 min后棄掉上清液；用生理鹽水洗滌4次；最后1次洗滌后吸取25 μL壓積紅細胞，用生理鹽水配制成 2%～5% 待滅活紅細胞懸液(20 μL壓積紅細胞加500 μL生理鹽水配制為3%的紅細胞濃度)；2%～5%待滅活紅細胞懸液與0.2 mol/L 2-Me 1∶4混合；37 ℃水浴孵育30 min，孵育期間混勻3～4 次；孵育結(jié)束后用生理鹽水洗滌4次，棄去上清液，用生理鹽水配成需要的紅細胞懸液濃度。

1.5檢測方法 病例1和病例2患者標本用微柱凝膠法行ABO和RhD血型試驗、直接抗人球蛋白試驗(DAT-IgG)；抗篩細胞和獻血者紅細胞滅活前后均采用微柱凝膠法、凝聚胺法與病例1和病例2患者標本行抗體篩查、交叉配血。按照試劑說明書進行試驗和結(jié)果判讀[7]。

1.6紅細胞輸注效果評價 病例1和病例2患者輸注紅細胞后24～48 h內(nèi)檢測血紅蛋白，依據(jù)血紅蛋白增加值和臨床癥狀體征的改善，綜合判斷紅細胞輸注效果。

2 結(jié) 果

2.1CD38單抗治療前病例1和病例2患者輸血相容性檢測 病例1和病例2患者在治療前抗體篩查、DAT-IgG、自身對照均陰性、交叉配血實驗主次側(cè)均無凝集無溶血，見表1。

表1 CD38單抗治療前病例1和病例2患者輸血相容性檢測結(jié)果

2.2CD38單抗治療后病例1和病例2患者輸血相容性檢測 病例1和病例2患者ABO和RhD血型不受影響，自身對照和DAT-IgG陽性。見表2?？贵w篩查試驗選擇含抗E、抗JKa、抗M抗體血漿做對照，用2-Me處理抗篩細胞，結(jié)果見表3。交叉配血試驗，用0.2 mol/L的2-Me處理獻血者紅細胞前后進行試驗,結(jié)果見表4。

表2 CD38單抗治療后病例1和病例2患者血型、DAT-IgG、自身對照結(jié)果

表3 CD38單抗治療后病例1和病例2患者和對照抗體篩查結(jié)果

表4 抗CD38單抗治療后病例1和病例2患者交叉配血結(jié)果

2.3輸注效果評價 微柱凝膠法交叉配血主側(cè)無凝集，次側(cè)凝集強度小于或等于自身對照及DAT-IgG凝集強度，故判為相合。住院治療期間，病例1患者共輸注13次、病例2患者共輸注19次相合紅細胞。輸注后24～48 h內(nèi)復查血常規(guī)，依據(jù)輸注1 U紅細胞可使體質(zhì)量為60 kg的成年人血紅蛋白(Hb)水平提高約5 g/L[或使血細胞比容(HCT)提高約0.015%]及臨床癥狀體征的改善，綜合判斷紅細胞輸注有效。病例1和病例2患者輸注前后Hb及HCT變化情況見表5、6。

表5 病例1患者輸注紅細胞效果評價

續(xù)表5 病例1患者輸注紅細胞效果評價

表6 病例2患者輸注紅細胞效果評價

3 討 論

本研究中病例1和病例2患者使用CD38單抗治療3 d后開始輸血相容性檢測，ABO及RhD血型檢測不受影響，符合DE VOOGHT等[8]報道的CD38抗原與抗CD38單抗的結(jié)合不影響患者ABO和RhD血型鑒定；直接抗球蛋白實驗由用藥前陰性轉(zhuǎn)為陽性，病例1患者呈1+凝集，病例2患者呈±凝集，由于CD38單抗藥物治療疾病時會結(jié)合到患者紅細胞表面，而紅細胞表面有不同程度表達的CD38抗原分子[3-5]，導致了DAT-IgG不同程度的陽性，符合SULLIVAN等[9]研究表明。

交叉配血和不規(guī)則抗體篩選實驗時，CD38單抗會結(jié)合到獻血者和篩選紅細胞表面，干擾交叉配血實驗主側(cè)和不規(guī)則抗體檢測[10-11]。本研究中交叉配血試驗同時采用微柱凝膠法和凝聚胺法，微柱凝膠法主側(cè)結(jié)果均為2+凝聚，凝聚胺法主側(cè)為無凝集，說明凝聚胺試驗對CD38相關的抗原-抗體反應不敏感，符合YEH等[12]報道的CD38單抗不干擾凝聚胺試驗。也可以解釋為在低離子環(huán)境下，CD38分子在胞外攜帶負電荷的羧基，極易與凝聚胺分子結(jié)合，進而干擾CD38分子與CD38單抗的結(jié)合。所以當患者需要緊急輸血時，沒有足夠的時間解決CD38單抗引起的凝集，可選擇凝聚胺法進行交叉配血試驗，同時參考用藥前的抗體篩選結(jié)果，發(fā)放經(jīng)凝聚胺法交叉配血相合的獻血者紅細胞即可。有條件的實驗室可對患者進行Rh血型分型，發(fā)放經(jīng)凝聚胺法交叉配血相合且Rh表型與患者相匹配的獻血者紅細胞，可最大限度降低致敏和同種抗體產(chǎn)生的風險[13]。

本報道中處理獻血者紅細胞和抗篩紅細胞的方法參考文獻[14]的操作標準，因國內(nèi)尚無0.2 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT)商品試劑，本實驗室無法獲得此試劑，考慮2-Me和DTT都屬于還原劑，故采用市售0.2 mol/L的2-Me處理紅細胞。病例1和病例2患者輸注經(jīng)2-Me處理后微柱凝膠法交叉配血相合的紅細胞后，均無溶血等輸血不良反應。本研究顯示，每輸注2 U紅細胞后Hb及HCT值均有增加，偶有Hb增加低于10 g/L，分析其原因可能與病例1和病例2患者輸液導致血液稀釋有關，隨訪發(fā)現(xiàn)其癥狀和體征均有改善，故綜合判斷輸注有效。說明經(jīng)0.2 mol/L的2-Me處理紅細胞配血相合后可安全輸注給經(jīng)DARA治療的患者，符合邵林楠等[15]提出的0.2 mol/L DTT與0.2 mol/L的2-Me去除紅細胞表面CD38抗原效果基本一致，無DTT試劑時可以用2-Me替代,也符合糜堅青等[13]制訂的2-Me處理紅細胞的制備和檢測流程。

本報道中處理后的紅細胞主側(cè)交叉配血都會呈輕微溶血反應，糜堅青等[13]提出該溶血是由2-Me試劑引起，并非不規(guī)則抗體的作用，不同品牌2-Me會出現(xiàn)不同程度的溶血，應避免使用造成大量溶血的試劑。處理后的獻血者紅細胞行微柱凝膠法交叉配血，主側(cè)部分呈弱凝集反應，這可能與試劑處理紅細胞的能力、紅細胞上CD38抗原數(shù)量、2-Me的濃度、2-Me與紅細胞的比例、微柱凝膠卡的靈敏度有關，本文未做更深入的研究。0.2 mol/L的2-Me滅活紅細胞過程中需多次洗滌及孵育，整個操作過程耗時較長，并非所有獻血者都能相合，因此建議實驗室在每次交叉配血試驗時準備多份獻血者紅細胞平行處理，可縮短DARA治療患者等待輸血時間及減少試劑的消耗。

2-Me會使紅細胞上的某些抗原反應性變性或減弱，在評估使用這些試劑的試驗結(jié)果時，應考慮到這一點。已知2-Me能使紅細胞表面的Kell血型抗原變性，由于東亞人群中Kell血型多態(tài)性單一，基本為K-k+型，K+血型的頻率約為0.07%，一般不做Kell血型抗原檢測[16],因此本研究未采取Kell血型抗原陽性為對照試驗，采用3個陽性對照標本，分別為高頻抗E抗體、抗JKa抗體、抗M抗體，選擇包含以上3個對應抗原的抗篩細胞反應，處理細胞前后的試驗結(jié)果一致，說明2-Me未破壞紅細胞上的E抗原、JKa抗原、M抗原，證明2-Me處理紅細胞方法有效。

與此同時，DARA治療患者及其家屬、護理人員、醫(yī)生、輸血科工作人員都需要了解CD38單抗藥物治療后對輸血相容性檢測的干擾及對輸血治療的影響。輸血科工作人員在進行輸血前審核時，應注意輸血申請單上的臨床診斷，當抗體篩選發(fā)現(xiàn)有非特異性凝集，需仔細查看患者的病例及用藥史，并與臨床醫(yī)生充分溝通，及時選擇正確的檢測方法。

綜上所述，使用0.2 mol/L的2-Me處理紅細胞后再進行輸血相容性檢測，可消除CD38單抗的干擾，為CD38單抗治療的患者提供安全有效的血液。