絨毛組織活檢聯(lián)合血清miR-423檢測在高危孕婦產(chǎn)前診斷中的價值

宋 冉,李繼霞,何 琳,劉 丹,楊志峰,焦 穎

河北省保定市第二醫(yī)院：1.婦科；2.產(chǎn)科，河北保定 071000

孕婦染色體異常是造成胎兒早產(chǎn)、流產(chǎn)及死胎的重要因素，在孕期進行染色體檢查對于優(yōu)生優(yōu)育具有重要價值[1]。流行病學調(diào)查顯示[2]，我國的出生缺陷新生兒比例可達到4%～6%。所以，通過產(chǎn)前診斷可以提升人口質量，產(chǎn)前診斷的方法是目前臨床研究的熱點之一。目前，國內(nèi)對于高危孕婦的確診主要依靠中孕期及孕晚期進行羊水穿刺或者臍帶穿刺來獲取標本并進行檢測[3]。但是，這種方法對于早期異常情況檢出的靈敏度較差，同時可能會對孕晚期孕婦的心理造成影響[4]。胎盤絨毛組織活檢主要是對孕周為11～13周的孕婦進行產(chǎn)前診斷[5]，對于重型珠蛋白生成障礙性貧血(以下簡稱“地貧”)及常見的染色體疾病可做到產(chǎn)前診斷，以便及早干預，減少孕婦中晚期的并發(fā)癥。微小核苷酸(miRNA)主要存在于機體的真核細胞中，母體血清miR-423對于神經(jīng)管缺陷的診斷具有明確價值[6]。本研究將絨毛組織活檢聯(lián)合血清miR-423檢測用于高危孕婦的產(chǎn)前診斷，旨在為臨床診斷提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年2月至2021年3月于本院診治的高危孕婦共120例納入研究作為高危組，年齡25～36歲、平均(29.57±2.09)歲，體質量指數(shù)為(25.25±2.18)kg/m2，孕周為(12.09±0.89)周，其中唐氏綜合征26例，東南亞缺失型α地貧13例，其他α地貧19例，β41-42雜合子型β地貧12例，β654雜合子型β地貧15例，β28雜合子型β地貧11例，β17雜合子型β地貧9例，其他β地貧15例。另外，選取同期正常妊娠的孕婦120例作為對照組。兩組年齡、孕周、體質量指數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有納入研究者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過(倫理批號為20180201)。納入標準：(1)年齡在40歲以下；(2)孕周為11～13周。排除標準：(1)有唐氏綜合征生育史者；(2)妊娠期糖尿病患者；(3)自身免疫性疾病患者；(4)有長期不良嗜好者，包括吸毒、酗酒等。

1.2方法 在超聲引導作用下，囑受檢孕婦膀胱充盈，使用絨毛組織活檢針經(jīng)宮頸進入胎盤內(nèi)，使用負壓注射器進行絨毛組織吸取。在無菌條件下，使用無菌生理鹽水對受檢孕婦的絨毛組織進行洗凈，對紅細胞及虹膜組織進行清除后，在倒置的顯微鏡下進行觀察，確認留下的組織僅為絨毛組織。然后，將絨毛組織使用無菌剪刀進行剪碎后，加入到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境條件設定為溫度37 ℃，二氧化碳濃度設定為5.5%，培養(yǎng)時間設定為10 h，在培養(yǎng)結束后，在瓶壁上發(fā)現(xiàn)5團以上的大克隆既可以收獲細胞。在收獲的細胞中加入秋水仙素后繼續(xù)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間設定為4～6 h，在常規(guī)狀態(tài)下對以上組織進行G顯帶，每位受檢者的計數(shù)為30個分裂相，至少對受檢者的5個核型進行分析，在檢測過程中，如果出現(xiàn)嵌合體則需要進行擴大計數(shù)。隨后對絨毛組織的DNA進行提取，然后進行DNA診斷。

血清miR-423檢測：所有研究對象均在入組后采集血液4 mL，3 000 r/min離心10 min取上清液，將樣品立即置于無DNA酶和RNA酶的滅菌采血真空管內(nèi)，將所得樣品在離心(3 000 r/min，20 min)后，按照Trizol試劑(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)說明書提取血清總RNA，以5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTGCACTGGATACGACTTCAGTT-3′為引物，采用實時熒光定量PCR(qPCR)進行檢測。檢測前使用紫外分光光度計進行miR-423濃度和純度的測定。

1.3觀察項目 (1)絨毛組織活檢與臨床最終診斷結果的一致性。(2)兩組血清miR-423水平。(3)聯(lián)合檢測的效能：采用受試者工作特征(ROC)曲線來分析絨毛組織活檢聯(lián)合血清miR-423檢測用于高危孕婦產(chǎn)前診斷的效能。靈敏度=100%×真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)),特異度=100%×真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)),符合率=100%×(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)，陽性預測值=100%×真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))，陰性預測值=100%×真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))。

2 結 果

2.1觀察絨毛組織活檢與臨床最終診斷結果的一致性 絨毛組織活檢對于唐氏綜合征、東南亞缺失型α地貧、其他α地貧、β41-42雜合子型β地貧、β654雜合子型β地貧、β28雜合子型β地貧、β17雜合子型β地貧、其他β地貧、無異常的診斷與臨床最終診斷結果的一致性較好，見表1。

表1 絨毛組織活檢與臨床最終診斷結果的一致性觀察(n)

2.2兩組患者的血清miR-423水平比較 高危組血清miR-423相對表達水平低于對照組(0.55±0.18vs.2.28±0.16,t=78.691，P<0.001)。

2.3聯(lián)合診斷效能分析 絨毛組織活檢聯(lián)合miR-423檢測聯(lián)合用于高危孕婦產(chǎn)前診斷的特異度高于單獨檢測(P<0.05)，見表2。

表2 聯(lián)合診斷效能分析

2.4ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，絨毛組織活檢聯(lián)合miR-423檢測用于高危孕婦產(chǎn)前診斷的曲線下面積大于單獨檢測，見表3。

表3 ROC曲線分析

3 討 論

產(chǎn)前診斷對于高危孕婦具有重要意義[7]，決定了是否會對胎兒進行干預。目前受到產(chǎn)前診斷設備及實驗技術的限制，國內(nèi)用于胎兒產(chǎn)前診斷的技術較為滯后[8]。在對患者早孕期絨毛組織的取材中，由于取材的絨毛組織較少，而且受到母體其他組織污染的可能性較高，術后并發(fā)癥發(fā)生的風險較高，各個機構對于絨毛組織的培養(yǎng)及染色體制備開展得不夠，這導致胎兒的遺傳性診斷存在一定不足。所以，在對高危孕婦的診斷中，及時有效地通過和其他指標的聯(lián)合使用以提升診斷效能[9]。在對孕婦絨毛組織進行取材的過程中，有可能會導致宮內(nèi)感染、陰道出血及流產(chǎn)等。在診斷能力較高的產(chǎn)前診斷中心，通常在早孕期(孕11～13周)對患者進行絨毛組織的取材，導致胎兒流產(chǎn)概率與既往的羊膜腔穿刺相當；而在對孕10周的孕婦進行絨毛組織取材時，胎兒發(fā)生橫向肢體短缺畸形的風險為1%～3%[10]，同時下頜肢體發(fā)育不良的風險顯著升高；在孕11～13周進行絨毛組織的取材，相對安全[11]。所以本研究選擇在孕11～13周對孕婦進行絨毛組織取材。在實際的檢測過程中，首先在B超的引導作用下，對孕婦進行絨毛組織進行采集，一方面可以避免引起胎兒的肢體發(fā)育障礙，同時孕11周的絨毛組織較為豐富，有助于B超下進行穿刺[12]。筆者發(fā)現(xiàn)在對患者絨毛組織進行取材過程中，在子宮前壁更容易到絨毛組織，但是當患者的子宮過度傾/屈時則存在一定的難度[13]。所以在實際的取材過程中，及時對患者的腹部進行加壓，同時囑患者進行膀胱充盈，必要時通過手法對子宮位置進行調(diào)整，有助于提升絨毛組織取材的成功率[14]。

本研究結果顯示，絨毛組織活檢與臨床最終診斷結果的一致性較好，但是仍存在一定的差異，所以在產(chǎn)前診斷過程中，可以聯(lián)合其他指標，提升診斷效能。已有的研究報道顯示[15]，孕婦血清中的miRNA主要是來自于造血細胞，與妊娠密切相關，同時miRNA的穩(wěn)定性較好，其檢測便于在臨床開展。所以，探討血清miR-423檢測在產(chǎn)前診斷中的應用，對于高危孕婦的產(chǎn)前診斷具有重要意義。有研究報道，產(chǎn)后母體血清miRNA會被快速清除，所以孕婦血清miRNA的檢測有望成為高危孕婦診斷的重要依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管缺陷胎兒的母體血清中miR-423水平呈顯著下降[6]。在本研究中，通過對研究對象進行絨毛組織活檢和miR-423水平的聯(lián)合檢測，提升了產(chǎn)前診斷的效能。但是本研究還存在一定的局限性，例如納入本研究的樣本量較小，還有待進一步地擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，絨毛組織活檢聯(lián)合血清miR-423檢測在高危孕婦產(chǎn)前診斷中的效能較高。