Galectin-9在多發(fā)性骨髓瘤患者Th17/Treg失衡中的意義

潘 鑫,王 娟,徐冬云,張亞輝,徐永茂

中國(guó)人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院腫瘤血液科，江蘇徐州 221000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高的血液系統(tǒng)腫瘤，好發(fā)于中老年人[1]。MM以分泌異常的單克隆漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)大量增殖為主要特征，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫狀態(tài)密切相關(guān)，特別是與T淋巴細(xì)胞亞群有關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞 17(Th17)均為重要的T淋巴細(xì)胞亞群，前者可控制自身免疫疾病和抑制腫瘤免疫反應(yīng)起到抗炎作用，后者主要通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17)而起到促炎作用，兩者在細(xì)胞分化及功能作用上相互抑制，共同維持機(jī)體局部免疫平衡[2-3]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MM患者體內(nèi)存在明顯的Th17/Treg失衡,表現(xiàn)為Th17細(xì)胞比例升高和Treg細(xì)胞比例降低，且有多種因子參與其中[4]。半乳糖凝集素9(Galectin-9)是一種急性髓系白血病、惡性淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)異常的半乳糖凝集素，主要參與細(xì)胞聚集黏附、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。相關(guān)研究顯示，Galectin-9可與其配體T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)結(jié)合，在機(jī)體免疫效應(yīng)階段清除效應(yīng)Th17細(xì)胞、抑制T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)作用，推測(cè)其可能通過(guò)與Tim-3作用而參與了Th17/Treg失衡過(guò)程[5]。本次研究通過(guò)檢測(cè)MM患者外周血Th17、Treg細(xì)胞水平及Galectin-9表達(dá)情況，探討Galectin-9在MM患者Th17/Treg失衡中的作用及與臨床病理關(guān)系，以期為臨床判斷MM病情進(jìn)展及預(yù)后提供一定參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年6月本院收治的105例初診MM患者(MM組)作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參考文獻(xiàn)[6]確診為MM的初診患者，采血前未進(jìn)行過(guò)放化療、免疫靶向治療等；(2)不伴其他漿細(xì)胞相關(guān)疾??；(3)研究對(duì)象知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急慢性感染性疾?。?2)傳染性疾?。?3)自身免疫性疾病、惡性腫瘤等或其他血液疾病。另選同期在本院體檢健康人員61例作為對(duì)照組，同樣排除急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、傳染性疾病、惡性腫瘤等或其他血液疾病。MM組男67例、女38例，年齡35～75歲、平均(54.76±8.72)歲；對(duì)照組男40例、女21例，年齡40～72歲、平均(55.12±8.34)歲。兩組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2方法

1.2.1Galectin-9、Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 采集MM組患者入院次日、對(duì)照組體檢當(dāng)日空腹靜脈血6 mL，取4 mL于抗凝管中保存，用于分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)：將全血與等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，加入淋巴細(xì)胞分離液，以2 000 r/min進(jìn)行密度梯度離心，吸取中間白色絮狀細(xì)胞層，為PBMC。在提取的PBMC中加入Trizol試劑提取總RNA，并檢測(cè)RNA濃度。采用SYBR@ Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃ 30 s退火。內(nèi)參選用β-action，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物為Galectin-9：上游5′-CTTTCATCACCACCATTCTG-3′，下游5′-ATCTGGAACCTCTGAGCACTG-3′；Tim-3：上游5′-CAGATACTGGCTAAATGGG-3′，下游5′-CTTGGCTGGTTTGATGAC-3′；β-action：上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.2.2外周血CD4+T、Th17、Treg水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀(BD公司，F(xiàn)ACSCalibur型)檢測(cè)，采用全血法配置分析液，F(xiàn)ACS Multi SET程序獲得CD4+T水平，采用BD Cell Quest軟件分析測(cè)定CD4+T中Th17、Treg水平，并計(jì)算Th17/Treg比例，試劑盒來(lái)自美國(guó)羅氏公司。

1.2.3血清IL-17、IL-10水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：取2 mL全血以3 500 r/min離心10 min后取上清液凍存用于ELISA檢測(cè)，將ELISA試劑盒室溫靜置30 min，按照需要濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在各孔中加入血清100 μL和標(biāo)準(zhǔn)品，36 ℃作用90 min，空白孔加入通用的稀釋液及標(biāo)準(zhǔn)品，洗板后在各反應(yīng)孔加入生物素化抗體100 μL，空白孔加入抗體稀釋液，作用60 min，洗板后各反應(yīng)孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，空白孔加入酶結(jié)合物稀釋液，作用30 min，洗板后各孔加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，作用15 min，隨后加入100 μL終止液，在3 min內(nèi)采用酶標(biāo)儀讀取各標(biāo)本吸光度(A值)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血Galectin-9、Tim-3 mRNA表達(dá)情況 MM組Galectin-9、Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。Pearson相關(guān)性分析顯示，Galectin-9 mRNA與Tim-3 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.376，P=0.005)。

表1 兩組外周血CD4+T細(xì)胞上Galectin-9表達(dá)情況

2.2兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況 MM組患者外周血Th17、Th17/Treg高于對(duì)照組，Treg水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。Pearson相關(guān)性分析顯示，Galectin-9 mRNA與Th17、Th17/Treg表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.491、0.389，P<0.05)，與CD4+T、Treg表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.408、-0.477，P<0.05)。

表2 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況

2.3兩組血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值比較 MM組血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值比較

2.4MM患者Galectin-9 mRNA表達(dá)與臨床病理關(guān)系 MM患者Galectin-9 mRNA隨ISS分期、DS分期增加而逐漸增高，見表4。Spearman相關(guān)性分析顯示，Galectin-9 mRNA與ISS分期、DS分期呈正相關(guān)(r=0.604、0.605，P<0.001)；染色體異常、血清游離輕鏈比值(sFLCR)異?；颊逩alectin-9 mRNA分別高于染色體正常、sFLCR正?；颊?，Pearson相關(guān)性分析顯示，Galectin-9 mRNA與染色體、sFLCR呈正相關(guān)(r=0.630、0.662，P<0.001)。

表4 MM患者Galectin-9 mRNA與臨床病理關(guān)系

續(xù)表4 MM患者Galectin-9 mRNA與臨床病理關(guān)系

3 討 論

MM是以漿細(xì)胞大量增殖為主要特性的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，患者體內(nèi)存在明顯的T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能異常。相關(guān)研究顯示，與健康人群相比，MM患者體內(nèi)存在CD4+T細(xì)胞水平抑制[7]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)無(wú)論初診或復(fù)發(fā)MM患者體內(nèi)均存在明顯的Th17/Treg比例偏高[8]。Treg細(xì)胞是一類在多種惡性腫瘤及免疫性疾病中表達(dá)異常的淋巴細(xì)胞，主要起到抑制效應(yīng)T細(xì)胞和維持自身免疫耐受作用，目前其在MM中表達(dá)存在爭(zhēng)議[9]。Th17細(xì)胞因具有促炎作用而被認(rèn)為在MM的溶骨性病變中起到促進(jìn)病程作用，而在MM中表達(dá)情況也并未達(dá)成共識(shí)[10]。這可能與MM患者個(gè)體微環(huán)境、疾病進(jìn)程等多種因素有關(guān)。本次研究結(jié)果顯示，MM患者外周血Th17占比明顯偏高，而Treg占比偏低，引發(fā)Th17/Treg失衡，且平衡向Th17方向移動(dòng)，提示Th17在MM發(fā)病過(guò)程中起作用。IL-17是Th17特異性分泌的細(xì)胞因子，能促進(jìn)初始T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，在眾多自身免疫疾病或惡性腫瘤中高表達(dá)。相關(guān)研究顯示，Treg細(xì)胞能通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等因子來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用[11]。本次研究中顯示MM患者IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值均高于健康人群，進(jìn)一步證實(shí)了MM中存在向Th17偏移。有學(xué)者認(rèn)為Th17、IL-17的表達(dá)增加是骨髓瘤細(xì)胞與其所處微環(huán)境相互作用結(jié)果[12]。還有研究認(rèn)為Th17能通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子與惡性腫瘤細(xì)胞結(jié)合，在促進(jìn)腫瘤血管生成、骨質(zhì)破壞等過(guò)程中起到重要作用[13]。本次研究中MM患者IL-10表達(dá)也升高，這可能與IL-10能引發(fā)免疫抑制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸有關(guān)。而IL-17/IL-10比值偏高提示MM患者體內(nèi)存在IL-17/IL-10比值失衡引發(fā)的免疫紊亂，且以Th17細(xì)胞分泌的IL-17為優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖和免疫抑制作用。Galectin-9是一種串聯(lián)重復(fù)的半乳糖凝聚素，其基因位于染色體17q11.1上，主要起到趨化嗜酸性粒細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等作用。相關(guān)研究顯示，Galectin-9可與Th1細(xì)胞表面標(biāo)記分子Tim-3結(jié)合，影響T細(xì)胞對(duì)IFN-γ的分泌，降低T細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用[14]。本研究顯示，MM組Galectin-9、Tim-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Tim-3、Galectin-9均參與了MM發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本次研究中血Galectin-9 mRNA與Tim-3 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在MM中可相互影響。多項(xiàng)研究顯示，Tim-3、Galectin-9共同參與了腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、血管形成、免疫逃逸等多過(guò)程調(diào)控，而Tim-3/Galectin-9通路能通過(guò)介導(dǎo)T細(xì)胞失能從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[15]。Tim-3目前已經(jīng)被證實(shí)能參與Th17的免疫調(diào)控過(guò)程，且能耗盡機(jī)體CD4+T細(xì)胞和有效抑制Treg細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能[16-17]。本研究中Galectin-9 mRNA表達(dá)與Th17、Th17/Treg表達(dá)呈正相關(guān)，與CD4+T、Treg表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示Galectin-9同樣參與了Th17/Treg失衡過(guò)程，而此過(guò)程可能是通過(guò)Galectin-9/Tim-3通路調(diào)節(jié)的。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Tim-3、Galectin-9與惡性腫瘤患者臨床病理參數(shù)之間存在相關(guān)，兩者高表達(dá)均可提示預(yù)后較差[18]。本次研究中MM患者Galectin-9表達(dá)與ISS分期、DS分期、染色體、sFLCR存在一定相關(guān)性。其中染色體異常及分期增加多提示預(yù)后不良；sFLCR提示克隆性漿細(xì)胞水平變化，此指標(biāo)變化早于骨髓瘤細(xì)胞變化[19-20]，提示Galectin-9表達(dá)可在早期提示MM病情進(jìn)展及預(yù)后，而此過(guò)程可能與Th17/Treg失衡情況密切相關(guān)。綜上所述，MM患者存在明顯的外周血Galectin-9水平偏高及Th17/Treg失衡，Galectin-9可能通過(guò)調(diào)控Tim-3表達(dá)參與了Th17/Treg失衡及MM病情進(jìn)展過(guò)程。