基于體外藥效研究復方夏枯草顆粒的制備工藝*

黃艷萍，郭殊瑋，劉 微，廖萬忠，蔣偉哲，付書婕

（廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021）

復方夏枯草顆粒的處方來源于廣西壯要方醫(yī)院，由夏枯草、連翹、槐花、甘草四味藥組成，具有清肝明目、軟堅散結、活血消癭之功效，多年的臨床應用顯示該方劑對各類亞急性、慢性甲狀腺炎、淋巴結節(jié)、乳腺增生、痔瘡腫痛等具有良好療效。為方便患者服用，促進中藥方劑的臨床應用，擬將原方湯劑開發(fā)為復方顆粒劑，在早期研究對人甲狀腺癌B-CPAP細胞抑制作用的基礎上，進一步優(yōu)化提取工藝，并依照顆粒劑的制劑工藝要求進行成型工藝研究，以期為該傳統(tǒng)方劑進一步的藥效及作用機制研究提供質量穩(wěn)定的顆粒劑。

1 儀器與材料

1.1 儀器

酶標儀（美國Biotek Synergy H1）；超凈工作臺（ESCO OptiMair）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo）；倒置熒光顯微鏡（Leica DMi8）；Agilent 1260 Infinity液相色譜儀和G1314F紫外檢測器；十萬分之一分析天平（Mettler-Toledo XS205DU）；超聲波清洗儀（上海冠特SG3300HPT）。

1.2 藥材、細胞與試劑

夏枯草（批號：200401）、連翹（批號：190901）、槐花（批號：200501）、甘草（批號：200301）均購于廣西藍正藥業(yè)；迷迭香酸對照品（批號：111871-202007，含量以98.1%計）；連翹苷對照品（批號：110821-201816，含量以95.1%計）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲狀腺癌B-CPAP細胞購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gemini，批號：A15H74K）；CCK-8試劑盒（尚寶生物，批號：202104）；PBS、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液均為Solarbio。

2 方法與結果

2.1 復方夏枯草顆粒處方提取物對甲狀腺乳頭狀癌細胞B-CPAP的抑制作用

2.1.1供試品溶液的配制 稱取處方比例藥材，分別用0%、20%、35%、50%、65%、80%乙醇回流提取2次，每次加12倍量溶媒回流1 h；合并兩次提取液，65℃減壓濃縮至一定稠度后，轉移放入烘箱，60℃干燥至干膏。刮取干膏，充分研磨成粉后密封儲存?zhèn)溆?。每個濃度的乙醇提取重復3次。

精密稱取各干膏粉約0.2 g，加入10 mL PBS，超聲30 min使充分溶解，過濾，吸取5 mL轉移到10 mL容量瓶內，PBS定容，混勻。細胞給藥前用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，用完全培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL。

2.1.2細胞抑制率檢測 取處于對數生長期且生長狀態(tài)良好的B-CPAP細胞[1-2]，調整細胞濃度為6×104個/mL（通過細胞個數優(yōu)選實驗得出的最適細胞濃度），以100μL孔接種于96孔板中（為避免邊緣效應，最外一圈不接種細胞，每孔加100μL PBS），置于37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后加藥；每組設6個副孔，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加100μL已配制好的含藥培養(yǎng)基（1 mg/mL），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后取出，倒置顯微鏡下觀察后，吸棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8的無血清培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h后于酶標儀490 nm波長下檢測OD值。按下列公式計算抑制率：細胞生長抑制率=（對照組OD平均值-實驗組OD平均值）/（對照組OD平均值-空白組OD平均值）×100%。通過抑制率大小來確定最佳醇提濃度，見表1、圖1。

由表1和圖1可知，不同濃度的處方醇提物分別處理B-CPAP細胞24 h和48 h后，35%和50%醇提物對細胞的抑制作用最強，作用24 h時，抑制率分別為85.9%、86.05%；作用48 h時，抑制率分別為93.98%、93.32%。兩個時間點的抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可認為在作用時間為24 h、48 h時，35%和50%醇提物對B-CPAP細胞的抑制作用相同。

圖1 不同濃度乙醇提取物對甲狀腺癌細胞B-CPAP增殖的影響

表1 不同乙醇濃度提取物對人甲狀腺癌細胞增殖的抑制率 n=6

2.2 復方夏枯草顆粒處方提取物中指標性成分的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～25 min，20%A→35%A；25～35 min，35%A→20%A；35～40 min，20%A）[3-4]，流速1.0 mL/min，檢測波長：278 nm，柱溫：30℃，進樣量：5μL。

2.2.2溶液制備（1）混合對照品溶液制備：精密稱定迷迭香酸和連翹苷適量，分別置于兩個10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成含迷迭香酸1.28 mg/mL含連翹苷1.60 mg/mL的單標儲備液。再分別精密吸取上述兩種單標儲備液各5 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成含迷迭香酸0.64 mg/mL、含連翹苷0.80 mg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液制備：精密稱定各提取物粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL的50%甲醇，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱重，50%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22μm濾膜，即得。（3）陰性樣品溶液制備：精密稱取缺夏枯草和連翹的陰性樣品1 g，制備方法同供試品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗 按照“2.2.1項”下的色譜條件進樣測定混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，色譜圖見圖2。結果顯示：迷迭香酸和連翹苷的保留時間分別約為16.5 min和19.1 min，陰性樣品無干擾，迷迭香酸和連翹苷與相鄰雜質峰分離良好，理論塔板數按連翹苷峰計不低于3 000，按迷迭香酸峰計不低于6 000，均符合規(guī)定。

圖2 對照品和提取物供試品HPLC圖

2.2.4線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2項”下的混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋成迷迭香酸（0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.24 mg/mL、0.32 mg/mL、0.64 mg/mL）和連翹苷（0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL）的系列標準溶液，按照“2.2.1項”下的色譜條件進樣測定。以對照品峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（X，mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表2。結果表明，迷迭香酸在0.04～0.64 mg/mL，連翹苷在0.05～0.80 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

表2 回歸方程與線性范圍

2.2.5不同乙醇濃度提取物中指標性成分的含量測定 按照“2.2.2項”下方法將“2.1.1項”下不同濃度乙醇提取的干膏粉制成供試品溶液，每組平行制備3份，以迷迭香酸和連翹苷轉移率為指標，為最佳乙醇提取濃度的選擇提供參考，見表3。

由表3可知，50%醇提物中的迷迭香酸轉移率最高，其次是35%醇提物；連翹苷在高濃度醇提物中的轉移率更高，在35%和50%醇提物中的轉移率較低，但也達到了80%以上，這與對B-CPAP細胞的抑制率趨勢并不一致，說明在對甲狀腺癌B-CPAP細胞的抑制作用中，連翹苷并不是處方中最重要的有效成分，其可能與其它成分共同發(fā)揮抑癌作用。

表3 不同乙醇濃度提取物中迷迭香酸和連翹苷的轉移率

2.3 最佳乙醇提取濃度確定

由細胞實驗可知，35%和50%醇提物對B-CPAP細胞的抑制作用最強，且二者差異無統(tǒng)計學意義。通過指標性成分的含量測定發(fā)現，迷迭香酸在50%和35%醇提物中的轉移率較高，而連翹苷的轉移率與對B-CPAP細胞的抑制率沒有顯著一致性。主要基于對細胞的抑制作用選擇，以及盡量減少提取溶劑中乙醇的含量，綜合考慮，選取35%乙醇作為復方夏枯草顆粒處方的最佳提取溶劑。

2.4 不同給藥濃度的35%醇提物對人甲狀腺癌BCPAP細胞增殖的抑制作用

精密稱取35%醇提物粉末20 mg，加入2 mL PBS，超聲溶解，過0.45μm微孔濾膜，備用；細胞給藥前用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，用完全培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL的母液，其它給藥濃度用此母液做梯度稀釋，補充溶劑為用PBS和完全培養(yǎng)基按1∶9稀釋的溶液。

由表4可知，隨著藥物濃度增大、作用時間延長，抑制作用越大，說明35%醇提物對人甲狀腺癌B-CPAP細胞有時間和濃度依賴性，表現出明顯的量—效和時—效關系，24 h、48 h的IC50分別為0.69 mg/mL、0.56 mg/mL。

表4 不同濃度35%醇提物對人甲狀腺癌B-CPAP細胞不同作用時間的OD值及抑制率 n=6

2.5 提取工藝研究

2.5.1浸泡條件考察 浸泡使藥材充分濕潤、膨脹，使其有效成分易于溶出，并可避免蛋白質凝固及淀粉糊化。通過測定藥材吸水率，確定加水量及浸泡時間。吸水率=（藥材濕重-藥材干重）/藥材干重×100%。如圖3所示，0～30 min藥材吸水率增加最快，30 min時為168.2%，30 min后吸水趨勢減緩，60 min時為205.1%，即吸水量為藥材的2.05倍。為節(jié)約時間，增加效率，選擇浸泡30 min，加水量浸過藥材2 cm左右為宜，約為12倍量水。

圖3 藥材吸水率與浸泡時間關系

2.5.2提取工藝研究以35%乙醇為提取溶劑，采用L9（34）正交表進行正交試驗，考察液料比、提取時間、提取次數3個因素。按處方比例稱取藥材，按正交設計表進行提取，每組做3個平行試驗，各項指標計算平均值[5-6]。通過細胞實驗發(fā)現，迷迭香酸轉移率和對細胞的增殖抑制趨勢較為一致，所以以迷迭香酸含量和綜合評分（綜合評分=迷香酸含量×0.4+連翹苷含量×0.4+干膏率×0.2）為分析指標，選擇最佳提取條件，見表5、表6。

表5 正交試驗因素水平

表6 正交試驗表及實驗結果

極差可以反映各因素對指標的影響程度，由表7對各因素3個水平均值的極差分析可知，迷迭香酸組中，3個因素的影響程度為B＞A＞C，其中B因素中水平2的均值（B2）最高，A因素中A2最高；綜合評分組中，3個因素的影響程度為C＞B＞A，C因素中C3最高，各因素優(yōu)選兩個指標中的極差較大者，則最佳提取條件為A2B2C3，即加入12倍量35%乙醇，提取3次，每次60 min。

表7 迷迭香酸含量和綜合評分的極差分析

2.6 最佳提取工藝驗證

為了驗證結果的準確性，保證工藝的穩(wěn)定可行，稱取處方量藥材按照選定的最佳工藝重復3次試驗。根據3次重復試驗結果，表明該工藝穩(wěn)定可行，見表8。

表8 工藝驗證結果

2.7 成型工藝研究

本方的處方量藥材約為35 g，提取率約為20%，則每次干膏粉服用量為7 g，一般口服顆粒劑劑量為10～15 g/包，則輔料加入量控制在3～8 g（藥輔比1∶0.4～1∶1.1）為宜。

采用濕法制粒，制劑工藝步驟：中藥提取物（干膏粉）+適當輔料→制軟材→制顆粒→干燥→整粒。通過考察顆粒成型率、流動性、吸濕性、溶化性等指標對輔料進行篩選。

2.7.1干膏粉的制備 按處方比例稱取藥材，根據優(yōu)選的最佳提取工藝進行提取、濃縮、干燥，烘干成干膏后粉碎備用（易吸濕，干燥柜內儲存）。

2.7.2輔料的選擇 預實驗選擇潤濕劑（乙醇）的濃度分別為60%、70%、80%、90%，發(fā)現由于干膏粉含糖量較高，且易吸濕，黏性強，在用60%、70%、80%乙醇時，若用量少則較松散，加大用量則明顯變黏，制粒時易堵塞篩孔；90%乙醇制得的軟材較合適制粒，故本實驗選擇乙醇濃度為90%。

取“2.7.1項”下干膏粉約20 g，分別與糊精、可溶性淀粉兩種常用輔料按照不同配比混勻，以90%乙醇作潤濕劑制備軟材，軟材的軟硬度標準為“手握成團，輕壓即散”，篩選結果見表9。

表9 輔料種類及配比篩選結果

2.7.3成型工藝考察評價指標 為優(yōu)選復方夏枯草顆粒的最佳輔料及其配比，實驗在各組軟材質量的基礎上，優(yōu)選第2、3、4號組軟材制粒，以成型率、流動性、吸濕性、溶化性為指標，考察最佳成型工藝，結果見表10。

表10 成型工藝指標評價表

根據制得的軟材情況并結合表11的顆粒劑考察指標可知，單用糊精、復合輔料淀粉∶糊精（1∶1）和（1∶2）時制得的軟材較易制備顆粒，通過比較3組顆粒的成型率、流動性、吸濕性和溶化性，發(fā)現4號組的成型率及流動性最好，3號組的吸濕性最大，各組都能在5 min內全部溶化，且4號組所用的輔料量最少，藥輔比（1∶0.8）在1∶0.4～1∶1.1的合理范圍內，綜合考慮最佳輔料選擇淀粉∶糊精（1∶2），乙醇濃度為90%。

2.8 放大驗證試驗

按照最佳提取工藝和成型工藝，制備3批復方夏枯草顆粒，按處方比例稱取各味藥材共約1 200 g，浸泡、提取、濃縮、干燥、粉碎后得浸膏粉，與適量輔料淀粉∶糊精（1∶2）混勻，噴以90%乙醇制軟材，濕法制粒，過16目篩整粒，60°C干燥至恒重。

由表11可知，3批藥材的平均出膏率為21.24%，制得的平均顆粒劑量為532.81 g，損失較小，顆粒收率較高，可進一步進行中試生產。

表11 3批顆粒劑的制備

3 討論

本實驗基于體外藥效研究，發(fā)現35%和50%醇提物對人甲狀腺癌B-CPAP細胞的抑制作用最強；并通過HPLC法測定處方不同乙醇濃度提取物中指標性成分的含量，發(fā)現50%和35%醇提物中迷迭香酸的轉移率較高，而連翹苷的轉移率與細胞抑制率趨勢無顯著關系，綜合分析，確定最佳提取溶媒為35%乙醇。傳統(tǒng)煎煮法為水提，不利于有效成分最大限度的溶出，本實驗基于對甲狀腺癌細胞的抑制作用，篩選出活性最強的提取物，以優(yōu)化處方的提取工藝，增強處方的治療作用。

處方中的君藥夏枯草散結消腫、疏肝解郁，其主要成分迷迭香酸可抑制多種人源腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[7]，與本實驗前部分的研究結果相契合，提取物中迷迭香酸的含量越高，對細胞的抑制作用越強。連翹具升浮宣散之力，清熱解毒，軟堅散結，其專屬性成分連翹苷、連翹酯苷具有顯著的生物學活性，各成分之間發(fā)揮協(xié)同作用而用于不同疾病的治療[8]。本實驗發(fā)現，處方中連翹苷的含量與其對細胞的增殖抑制沒有明顯的濃度依賴性，連翹苷是否是處方中抗甲狀腺癌的活性成分，還有待繼續(xù)研究。

本實驗采用多指標綜合評價的方法，將體外活性研究與指標性成分的含量測定綜合考察，優(yōu)化中藥提取工藝以提高藥物療效，有利于篩選出中藥復雜成分中的重要活性成分。將原方湯劑改進為方便攜帶服用的顆粒劑，在保證原有功效的基礎上，優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取條件為加入12倍量35%乙醇，回流提取3次，每次60 min，煎煮前浸泡30 min；最佳成型工藝為輔料淀粉和糊精（1∶2），藥輔比約1∶0.8，90%乙醇為潤濕劑，所制得的顆粒符合顆粒劑的各項檢查標準。